吳 鏑, 王新剛, 王 玫, 宋 濤, 尹寧北, 趙振民

實(shí)驗(yàn)研究

4q31區(qū)域STR位點(diǎn)D4S413多態(tài)性與中國(guó)漢族人群非綜合征型唇腭裂的關(guān)聯(lián)研究

吳 鏑, 王新剛, 王 玫, 宋 濤, 尹寧北, 趙振民

目的探討4q31區(qū)域STR位點(diǎn)的基因多態(tài)性與中國(guó)漢族人群非綜合征型唇腭裂發(fā)生的相關(guān)性。方法收集中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院214個(gè)非綜合征型唇腭裂核心家系(患者及其父母)樣本。在4號(hào)染色體4q31-q32分布10個(gè)短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)。采用ABI 3730DNA分型儀進(jìn)行短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)的基因分型。分別采用Mendel和FBAT兩種軟件進(jìn)行傳遞不平衡檢驗(yàn)分析。結(jié)果采用Mendel軟件進(jìn)行傳遞不平衡檢驗(yàn)分析，短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)D4S413與中國(guó)漢族人群非綜合征型唇腭裂有相關(guān)性(P=0.0372)，采用FBAT軟件進(jìn)行傳遞不平衡檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)D4S413的與中國(guó)漢族人群非綜合征型唇腭裂有相關(guān)性(P=0.01974)，等位基因297過(guò)傳遞。但經(jīng)過(guò)多重檢驗(yàn)校正后，P>0.05。結(jié)論4q31區(qū)域短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)D4S413可能與中國(guó)漢族人群非綜合征型唇腭裂關(guān)聯(lián)，但需要大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。

非綜合征型唇腭裂； 短串聯(lián)重復(fù)序列； 傳遞不平衡檢驗(yàn)

唇腭裂是最常見(jiàn)的出生缺陷之一，其發(fā)病率隨種族和地域不同而有明顯變化。臨床中最常見(jiàn)的非綜合征型唇腭裂(nonsyndromic cleft lip with or without palate, NSCLP)是一種多基因復(fù)雜疾病，其致病風(fēng)險(xiǎn)因素包括遺傳因素、環(huán)境因素以及遺傳與環(huán)境因素的交互作用。近年來(lái)，通過(guò)連鎖分析(linkage analysis)[1]和全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study, GWAS)[2-3]，相繼發(fā)現(xiàn)了一些新的易感基因和區(qū)域，但是多數(shù)位點(diǎn)并未找到明確的致病突變。自2000年初開始，多個(gè)研究小組通過(guò)基于家系的全基因組連鎖分析，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些易感區(qū)域：1q32、2p、3q27-28、9q21、14q21-24、16q24。由于種族差異、地域差異等異質(zhì)因素的影響及樣本量不足等因素，造成結(jié)果的重復(fù)性較差。其中，Marazita于2002年選取了36個(gè)中國(guó)上海復(fù)雜家系，387個(gè)短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeats, STR)位點(diǎn)，完成了唯一一次針對(duì)中國(guó)人群的全基因組掃描進(jìn)行連鎖分析后發(fā)現(xiàn)，其多點(diǎn)HLOD最高峰在4q31(2.5，α= 0.37)[1]。并且該位點(diǎn)在其他民族(菲律賓人[4]和敘利亞人[5])中也得到支持。經(jīng)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(national center for biotechnology information, NCBI)檢索發(fā)現(xiàn)，4q31已被在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)收錄，命名為OFC4。筆者的研究以漢族人群的結(jié)果為主要參考，結(jié)合其他研究結(jié)果，尤其是黃色人種，確定4q31為候選區(qū)域，進(jìn)行精細(xì)定位。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究群體

樣本來(lái)源于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院唇腭裂中心2011-2013年收錄的中國(guó)漢族人群非綜合征型唇腭裂核心家系(包括患兒及其父母)。為排除綜合征型唇腭裂的影響并對(duì)患者進(jìn)行正確的分級(jí)，我們對(duì)所有的患兒及其父母進(jìn)行了詳細(xì)的問(wèn)卷調(diào)查，并由2名?？漆t(yī)師分別進(jìn)行唇腭部檢查。收集所選樣本的唇腭裂家族史情況、性別、年齡、是否有其他重大疾病等流行病學(xué)資料及母親孕期受過(guò)致畸物質(zhì)影響的患者；排除母親孕期大量吸煙、酗酒的患者。入選者均為非綜合征型唇腭裂家系。

共選取核心家系214個(gè)，其中完整核心家系(即包括患兒及其父母)205個(gè)，不完整核心家系(即患兒及其父親或母親)9個(gè)，22個(gè)家系有陽(yáng)性家族史。與入選家系成員簽定知情同意書，本研究中所涉及樣本的采集、臨床檢測(cè)、基因篩查與功能分析等，均通過(guò)本單位倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，并在患者及家屬知情情況下進(jìn)行。為患者保密，并嚴(yán)格遵守國(guó)家相關(guān)法律法規(guī)。

1.2 DNA的提取及定量分析

分別抽取核心家系成員靜脈血6 ml，用于基因組DNA的提取。應(yīng)用基因組DNA純化試劑盒QIAamp DNA blood mini kit(QIAGEN-Sample & Assay Technologies, 德國(guó))，提取血樣中的基因組DNA。所提DNA先根據(jù)電泳結(jié)果初步判斷提取質(zhì)量，再應(yīng)用NanoDrop ND1000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(NanoDrop Technologies, 美國(guó))測(cè)定DNA質(zhì)量和濃度，保證樣本的一致性。

1.3 STR分型

STR熒光位點(diǎn)盡量選用雜合度大于0.6的2～4個(gè)核苷酸重復(fù)序列，產(chǎn)物長(zhǎng)度盡量控制在150～250 bp。根據(jù)NCBI提供的基因組圖上短串連重復(fù)序列熒光位點(diǎn)位置及順序，在目標(biāo)區(qū)域染色體4q31上(物理距離34 Mb)根據(jù)基因密度，平均且合理分布10個(gè)短串連重復(fù)序列熒光位點(diǎn)。其中D4S413為美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems, ABI) Linkage Mapping Set version 2.5中的商用熒光位點(diǎn)引物(引物序列未提供)；其余引物均根據(jù)NCBI上提供的引物序列，由上海英駿生物技術(shù)有限公司(Invitrogen)合成，5′末端FAM羧基熒光素修飾。STR具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

應(yīng)用PCR技術(shù)(ABI PCR基因擴(kuò)增儀2720)對(duì)目的片斷進(jìn)行擴(kuò)增。每5 μl PCR反應(yīng)體系含有10 ng全基因組DNA作為模板，在PCR擴(kuò)增緩沖體系中含有25 mM MgSO40.4 μl，2.5 mM dNTP 0.5 μl，緩沖液0.5 μl，正反向引物混合物1.0 μl，TaKaRa Taq酶0.04 μl。產(chǎn)物純化后，采用ABI 3730自動(dòng)基因分析儀毛細(xì)管電泳技術(shù)掃描PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用3730/3730xl Data Collection Software v 3.0軟件，將電泳收集的電泳圖譜信息，經(jīng)過(guò)電子計(jì)算機(jī)處理成數(shù)據(jù)信息。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

對(duì)核心家系的基因分型結(jié)果進(jìn)行孟德爾遺傳錯(cuò)誤檢查。應(yīng)用Mendel 8.0.0軟件中的Genetic Equilibrium功能，計(jì)算每個(gè)STR位點(diǎn)基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。采用傳遞不平衡檢驗(yàn)(transmission disequilibrium test, TDT)來(lái)定位與非綜合征型唇腭裂相關(guān)的位點(diǎn)。TDT算法已植入多個(gè)軟件，不同的軟件對(duì)于TDT算法有不同的擴(kuò)展。本研究分別采用兩個(gè)軟件Mendel和FBAT進(jìn)行TDT分析，以期得到更加公允的結(jié)果。我們對(duì)214個(gè)家系進(jìn)行了TDT檢驗(yàn)。FBAT可設(shè)置顯性、隱性和加性遺傳模式來(lái)檢驗(yàn)關(guān)聯(lián)。

2 結(jié)果

2.1 樣本臨床基本資料分析

214例患者中，男性156例，女性58例，男女比例為2.7∶1.0?；颊吣挲g2個(gè)月至23歲，平均3歲。這214個(gè)家系中，22個(gè)家系報(bào)告有陽(yáng)性家族史，192個(gè)家系否認(rèn)有家族史。按NSCLP亞型分類，唇裂伴腭裂103個(gè)，單純唇裂111個(gè)。

表1 STR位點(diǎn)及引物列表

2.2 樣本DNA質(zhì)量分析

電泳分析可見(jiàn)，從抗凝靜脈血中提取出的全基因組DNA，在凝膠上顯示條帶清晰，無(wú)雜帶。即認(rèn)為所提取出的全基因組DNA樣本完整，無(wú)降解，可用于PCR擴(kuò)增。經(jīng)NanoDrop ND1000測(cè)定，DNA濃度最高值達(dá)120 ng/μl，最低值為10 ng/μl，基本保持在40 ng/μl，OD260/OD280基本保持在1.8。因此，認(rèn)為DNA濃度達(dá)到STR基因分型實(shí)驗(yàn)需求。

2.3 STR基因型結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析

STR位點(diǎn)D4S1603、D4S2431共測(cè)390個(gè)樣本，即130個(gè)家系；D4S1644、D4S2998、D4S3021實(shí)測(cè)537個(gè)樣本，即179個(gè)家系；D4S1629、D4S413、D4S1498、D4S1589和D4S1556實(shí)測(cè)642個(gè)樣本，即214個(gè)家系。所有STR位點(diǎn)基因分型成功率保持在95%以上。圖1為經(jīng)3730/3730xl Data Collection Software v 3.0軟件收集的電泳圖譜信息，圖2為經(jīng)Genemarker軟件處理的STR峰圖。

圖1 D4S3021典型電泳圖譜圖2 D4S3021典型雜合子峰圖Fig1 Typical electrophoregram of D4S3021.Fig2 Typical heterozygote peak of D4S3021.

2.4 孟德爾遺傳錯(cuò)誤檢查結(jié)果

部分家系在多個(gè)STR位點(diǎn)的基因型出現(xiàn)孟德爾遺傳錯(cuò)誤，認(rèn)為其家系關(guān)系不明確，故在后續(xù)分析過(guò)程中去除這類家系。

2.5 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果

對(duì)父母基因型進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，所有STR位點(diǎn)P>0.05，因此，所選取的研究樣本的基因型符合整個(gè)群體的情況；對(duì)患兒的基因型進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，所有STR位點(diǎn)P>0.05，即患兒的基因型與整體人群并沒(méi)有明顯的偏離。

2.6 TDT分析結(jié)果

2.6.1 Mendel軟件對(duì)TDT分析結(jié)果 采用Mendel軟件，對(duì)所有通過(guò)孟德爾遺傳錯(cuò)誤檢查的可用家系進(jìn)行TDT分析，得到TDT1的P值、TDT2的P值、傳遞和未傳遞的風(fēng)險(xiǎn)等位基因數(shù)(表2)。各STR位點(diǎn)根據(jù)等位基因頻率合并等位基因，使其最小等位基因頻率達(dá)到0.1，之后進(jìn)行TDT計(jì)算。采用TDT1算法，在STR位點(diǎn)D4S413的P<0.05，否定零假設(shè)，認(rèn)為在該位點(diǎn)對(duì)TDT的檢驗(yàn)，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，D4S413與NSCL/P有相關(guān)性。

2.6.2 FBAT軟件對(duì)TDT分析結(jié)果 采用FBAT軟件進(jìn)行TDT分析，可采用不同的遺傳模式進(jìn)行分析。

表2 Mendel軟件的TDT分析結(jié)果

注：*P< 0.05

當(dāng)選用相加遺傳模型，多等位基因模式時(shí)，STR位點(diǎn)D4S413的P<0.05 (P=0.01974)。但經(jīng)過(guò)多重檢驗(yàn)校正后，P>0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。顯性遺傳模型多等位基因模式下，STR位點(diǎn)D4S413的P<0.05(P=0.014661)。隱性遺傳模型多等位基因模式下，只有7個(gè)STR位點(diǎn)可用該模型計(jì)算。且所有可計(jì)算位點(diǎn)P>0.05。

3 討論

本研究基于以往實(shí)驗(yàn)已經(jīng)得到的結(jié)果，選用NSCL/P核心家系樣本，采用TDT分析方法，對(duì)中國(guó)漢族人群NSCL/P易感基因候選區(qū)域4q31-q32進(jìn)行深入地研究。這一區(qū)域已有多項(xiàng)研究支持，但并未定位到致病基因。1994年，S Beiragh發(fā)現(xiàn)，其中2個(gè)位點(diǎn)D4S175和D4S192與唇腭裂有連鎖關(guān)系。在對(duì)中國(guó)36個(gè)唇腭裂家系的全基因連鎖分析研究中，Maraxita等[1]發(fā)現(xiàn)，在隱性遺傳模式下，位于4q的STR位點(diǎn)D4S1629存在多點(diǎn)HLOD最高值(2.5)。2003年，S Beiraghi在一對(duì)患唇腭裂的父子中，檢測(cè)到4號(hào)染色體有平衡臂間倒位，inv(4)(p13q21)。發(fā)現(xiàn)4q21的斷裂點(diǎn)干擾了SCD5基因2號(hào)外顯子。

在本研究中，TDT分析發(fā)現(xiàn)NSCL/P和STR位點(diǎn)D4S413可能有關(guān)聯(lián)。在D4S413區(qū)域附近有PDGFC、GLRB和GLRA2三個(gè)基因。其中血小板源生長(zhǎng)因子PDGF在哺乳動(dòng)物器官形成的多個(gè)階段起重要作用[6]。PDGF通過(guò)與PDGF受體(PDGFRs)結(jié)合而發(fā)揮作用。其中，PDGF-CC與PDGFR-αα和-αβ結(jié)合。研究發(fā)現(xiàn)，PDGFR-α對(duì)神經(jīng)脊細(xì)胞的發(fā)育和正常顱面發(fā)育起重要作用(P Soriano, 1997年)。生化實(shí)驗(yàn)和活體基因靶實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PDGF-C是PDGFR-α信號(hào)通路上一個(gè)重要組成[7]。PDGF-C和PDGFR-α在胚胎和出生后的生長(zhǎng)發(fā)育，特別是在腭發(fā)生過(guò)程中起重要作用。

在動(dòng)物模型中已驗(yàn)證，Pdgfr-α突變，以及其Pdgf配體，包括Pdgf-c突變，會(huì)影響頜面發(fā)育，導(dǎo)致頜面裂。另外，通過(guò)基因敲出(Pdgfr-α-/-小鼠模型)或致畸原(維甲酸)抑制PDGF-C表達(dá)活性，會(huì)干擾在鰓弓發(fā)育過(guò)程中MMPs和TIFs的作用[8]。PDGF-C的表達(dá)還會(huì)受到FGF信號(hào)通路和小分子類泛素修飾因子(small ubiquitin-like modifier modification, SUMO)的影響[9]。由于FGF信號(hào)通路的改變，也會(huì)導(dǎo)致腭裂的發(fā)生，SUMO和PDGF-C之間的相互作用，以及和環(huán)境危險(xiǎn)因素的相互作用，都會(huì)影響唇腭裂的易感性。

目前，已有多個(gè)針對(duì)PDGF-C與人類NSCLP的相關(guān)研究[10-12]。在NSCL/P患兒的PDGF-C啟動(dòng)子區(qū)域rs17035464到D4S1498，長(zhǎng)度約14 kb，出現(xiàn)片段性母源單親二體性現(xiàn)象。以上對(duì)人類NSCLP的研究，PDGF-C有陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)的研究樣本，都來(lái)自于中國(guó)人群，提示PDGF-C可能是中國(guó)人群特有的易感基因。

綜上所述，本研究通過(guò)TDT分析發(fā)現(xiàn)，NSCL/P和STR位點(diǎn)D4S413相關(guān) (P= 0.01974)。等位基因297過(guò)傳遞。但是，經(jīng)過(guò)多重檢驗(yàn)校正后，P>0.05。因此，認(rèn)為D4S413可能與NSCL/P關(guān)聯(lián)，D4S413附近的PDGFC基因突變，可能導(dǎo)致腭裂的發(fā)生，但需要更大的樣本量以及進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

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AssociationstudybetweenSTRmarkerD4S413polymorphismon4q31andnonsyndromiccleftlipwithorwithoutpalateinHanChinese

WUDi,WANGXin-gang,WANGMei,etal.

(CenterforCleftLipandPalate,PlasticSurgeryHospital,ChineseAcademyofMedicalScience,Beijing100144,China)

ObjectiveTo explore the association between D4S413 polymorphism on 4q31 and nonsyndromic cleft lip with or without palate in Chinese Han people.MethodsWe collected 214 NSCLP case-parent trios recruited through CL/P treatment center in Plastic Surgery Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences. 10 STR markers were selected on 4q31-q32. STR markers were genotyped by ABI 3730 DNA analyzer. The transmission disequilibrium test (TDT) was analyzed using two programs, Mendel and the family-based association test (FBAT).ResultsAnalyzed by Mendel, we founded significant association between the disease status and STR marker D4S413 (P= 0.0372). Analyzed by FBAT, we founded most-significant association between the disease status and STR marker D4S413 (P= 0.01974). Allele 297 was more frequently transmitted to the affected children. However, after multiple tests correction, the p-value did not touch the borderline.ConclusionAssociation may exist between D4S413 on 4q31 and nonsyndromic cleft lip with or without palate in Han Chinese. A large amount of samples will be included in the further study.

Nonsyndromic cleft lip with or without palate; Short tandem repeats; Transmitted disequilibrium test

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助(81101440)

100144 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院 唇腭裂中心(吳 鏑，宋 濤，尹寧北，趙振民)；首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院 口腔科(王新剛)；卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院 流行病學(xué)系(王 玫)

吳 鏑(1979-)，女，遼寧朝陽(yáng)人，主治醫(yī)師，博士.

趙振民，100144，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院 唇腭裂中心，電子信箱:zhaozhenmin0098@vip.sina.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.12.017

R329.23

A

1673-7040(2014)12-0747-04

2014-08-31)