張小俊，趙志鴻，張壯麗，王桂芳，陳慧平，鄒 敏

(1.鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南鄭州 450001;2.鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院藥化室，河南鄭州 450052)

艾葉為菊科植物艾 Artemisia argyi Lévl.et Vant.的干燥葉，有溫經(jīng)止血、散寒止血之功效，在我國大部分地區(qū)都有分布［1］。揮發(fā)油是其主要有效成分群之一，有研究報(bào)道其對多種細(xì)菌、病毒、真菌有殺滅或抑制作用［2-3］。水蒸氣蒸餾法(Steam Distillation)是分析植物中揮發(fā)性成分的傳統(tǒng)提取技術(shù)［4-6］，但其所需樣品量大，耗費(fèi)時(shí)間長，提取效率低，易造成揮發(fā)性化合物的損失及化學(xué)變化。頂空萃取 (Headspace Extraction)是一種無溶劑、簡單、快捷的提取植物中揮發(fā)性成分的新方法［7-8］。

本實(shí)驗(yàn)采用頂空萃取對樣品進(jìn)行處理，再用氣相色譜-質(zhì)譜 (GC-MS)聯(lián)用技術(shù)對11批不同產(chǎn)地艾葉中揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，對其主要色譜峰進(jìn)行歸屬，建立指紋圖譜共有模式，并與傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾法建立的指紋圖譜進(jìn)行比較。同時(shí)運(yùn)用相似度計(jì)算軟件、聚類分析對其進(jìn)行化學(xué)模式識別分類研究，為艾葉藥材中揮發(fā)性成分的質(zhì)量控制和品質(zhì)評價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器與試劑 7890A/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 (美國Agilent公司);G1888頂空進(jìn)樣器 (美國Agilent公司);固相微萃取手柄及聚二甲基硅氧烷 (PDMS，100μm)萃取頭 (美國 Supelco公司)，萃取頭在使用前按說明書上條件活化;AB135-S十萬分之一電子天平 (瑞士 METTLER TOLEDO公司);揮發(fā)油提取器;無水硫酸鈉 (分析純);正己烷 (色譜純);水為重蒸水。

1.2 樣品 艾葉分別購自不同醫(yī)藥單位，由鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院劉晨江研究員鑒定，為Artemisia argyi Lévl.et Vant.的干燥葉，是 《中國藥典》收載的藥用品種。共11個(gè)樣品，產(chǎn)地詳見表1。

表1 樣品來源Tab.1 Samples from different sources

2 方法與結(jié)果

2.1 水蒸氣蒸餾法 取干燥的艾葉適量進(jìn)行粉碎，稱取100 g，精密稱定，加1 L水浸泡4 h，參照《中國藥典》2010年版一部附錄XD［1］揮發(fā)油測定法 (甲法)提取。得到藍(lán)綠色油狀物，收油率為0.39%～0.61%。得到的揮發(fā)油用2 mL正己烷萃取，經(jīng)無水硫酸鈉干燥24 h后，取1 mL稀釋至10 mL，進(jìn)樣1 μL進(jìn)行測定。

2.2 頂空萃取法 取干燥的艾葉適量進(jìn)行粉碎，過40目篩，稱取1 g，精密稱定，置20 mL頂空瓶中，用具有聚四氟乙烯墊的密封蓋密封，100 μmPDMS萃取頭80℃萃取40 min，之后在氣相色譜進(jìn)樣口250℃解吸附3 min，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測。在萃取前，將萃取頭在氣相色譜進(jìn)樣口250℃活化10 min。萃取手柄深度規(guī)固定在#2。

2.3 GC-MS測定條件

2.3.1 色譜條件 DB-1毛細(xì)管柱(30 m×250 μm ×0.25 μm);載氣 He 氣 (99.999%)，柱流量1.0 mL/min;進(jìn)樣口溫度250℃;分流比20∶1;程序升溫，起始溫度50℃，維持5 min，以3℃/min升至200℃，再以20℃/min升至280℃，維持6 min。

2.3.2 質(zhì)譜條件 電子轟擊離子源 (EI);電子能量70 eV;離子源溫度230℃;接口溫度280℃;12～400 amu掃描;數(shù)據(jù)采集速率3.68次/s;水蒸氣蒸餾法溶劑延遲2.3 min。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度 取1號藥材，分別按上述條件，同一樣品連續(xù)測定5次，考察色譜峰保留時(shí)間和峰面積的一致性。結(jié)果頂空萃取法各色譜峰相對保留時(shí)間的RSD＜0.1%，相對峰面積的RSD＜0.3%;水蒸氣蒸餾法各色譜峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD均＜0.03%。說明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性 取1號藥材，分別按上述條件，連續(xù)7 d進(jìn)行測定，結(jié)果頂空萃取法各色譜峰相對保留時(shí)間的RSD＜0.04%，相對峰面積的RSD＜0.4%;水蒸氣蒸餾法各色譜峰相對保留時(shí)間的RSD＜0.03%，相對峰面積的RSD＜0.2%。說明一周內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性 取1號藥材，分別按上述條件進(jìn)行檢測，結(jié)果頂空萃取法各色譜峰相對保留時(shí)間的RSD＜0.2%，相對峰面積的RSD＜4.1%;水蒸氣蒸餾法各色譜峰相對保留時(shí)間的RSD＜0.03%，相對峰面積的RSD＜2.2%。說明重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜的分析與評價(jià)

2.5.1 特征共有峰的確定與歸屬 11批藥材，按“2.1”、“2.2”和“2.3”項(xiàng)條件提取和測定，得總離子流圖 (TIC)。圖1為1號藥材頂空萃取法總離子流圖，共檢出87個(gè)色譜峰。圖2為1號藥材水蒸氣蒸餾法總離子流圖，共檢出104個(gè)色譜峰。將GC-MS數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件”中，設(shè)置兩點(diǎn)校正，得11批藥材總離子流色譜疊加圖，圖3和圖4分別為11批藥材頂空萃取法和水蒸氣蒸餾法總離子流色譜疊加圖。11批藥材頂空萃取法共有特征峰31個(gè)，水蒸氣蒸餾法共有特征峰37個(gè)，以1，8-桉葉油素作為參照峰(S)，分別計(jì)算各特征峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積，并對共有峰用NIST05質(zhì)譜庫檢索進(jìn)行定性分析，匹配度90%以上作為準(zhǔn)確鑒定。結(jié)果見表2、表3。

圖1 1號藥材頂空萃取法總離子流圖Fig.1 TIC of sample 1 by headspace extraction

圖2 1號藥材水蒸氣蒸餾法總離子流圖Fig.2 TIC of sample 1 by steam distillation

圖3 11批藥材頂空萃取法總離子流色譜疊加圖Fig.3 TICs of 11 batches of samples by headspace extraction

圖4 11批藥材水蒸氣蒸餾法總離子流色譜疊加圖Fig.4 TICs of 11 batches of samples by steam distillation

表2 11批艾葉藥材頂空萃取法共有峰的相對保留時(shí)間與相對峰面積的比值Tab.2 Ratio of relative retention time(RTR)and relative peak area(RPA)of 11 batches of samples by headspace extraction

表3 11批艾葉藥材水蒸氣蒸餾法共有峰的相對保留時(shí)間與相對峰面積的比值Tab.3 Ratio of relative retention time(RTR)and relative peak area(RPA)of 11 batches of samples by steam distillation

續(xù)表3

2.5.2 指紋圖譜相似性分析 采用“中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件”對測定結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，以軟件生成的對照圖譜為對照模板，以夾角余弦法進(jìn)行計(jì)算，得11批不同產(chǎn)地艾葉藥材中揮發(fā)性成分的相似性評價(jià)，結(jié)果見表4，頂空萃取法與水蒸氣蒸餾法相似度計(jì)算結(jié)果基本一致，11批藥材的相似度都在0.9以上。

表4 11批艾葉藥材中揮發(fā)性成分的相似度Tab.4 Similarity of volatile components about 11 of batches of samples

2.5.3 系統(tǒng)聚類分析 聚類分析 (Cluster Analysis)是根據(jù)事物本身的特性研究個(gè)體分類的方法，可用于研究對象的分類與鑒定［9］。對頂空萃取法11批樣品中共有峰的相對峰面積用PASW Statistics軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類，采用類間平均鏈鎖法 (Between-group Linkage)和歐氏平方距離(Squared Euclidean Distance)作為樣品測度，繪出樹狀圖，見圖5。

結(jié)果表明，11批樣品可以分為兩大類，樣品1、2、3、4、6、8、10，11聚為Ⅰ類，相似度都在0.96以上;樣品5、7、9聚為第Ⅱ類，相似度在0.96以下。樣品5、7、9中含龍腦、石竹烯及氧化石竹烯量較高。

3 討論

3.1 頂空萃取所得的31個(gè)共有特征峰中有21個(gè)峰與水蒸氣蒸餾所得的共有特征峰成分相同，雖然兩種方法所得共有特征峰及相對峰面積有差別，但兩種方法所得的相似性分析結(jié)果基本一致。與水蒸氣蒸餾相比，頂空萃取無溶劑、樣品用量少、快捷，適合大批量樣品處理。

圖5 11批艾葉藥材揮發(fā)性成分聚類分析圖Fig.5 Hierarchical cluster analysis figure of volatile components from 11 batches of samples

3.2 頂空萃取指紋圖譜中31個(gè)共有特征峰與水蒸氣蒸餾指紋圖譜中37個(gè)共有特征峰的特征成分在相對保留時(shí)間2.45以前比較相似，在此以后差別較大，可能是頂空萃取對高沸點(diǎn)物質(zhì)的選擇性較差。

3.3 在頂空萃取中相對含有量較高的成分有1，8-桉葉油素、α-蒎烯、1-甲基-4-(1-甲乙基)-苯、蒿酮、蒿醇、樟腦、龍腦、4-甲基-1-(1-甲乙基)-3-環(huán)己烯-1-醇、石竹烯、氧化石竹烯;在水蒸氣蒸餾中相對含有量較高的成分有1，8-桉葉油素、3，3，6-三甲基-1，4-庚二烯-6-醇、蒿酮、蒿醇、樟腦、龍腦、4-甲基-1-(1-甲乙基)-3-環(huán)己烯-1-醇、α-松油醇、順式-香芹醇、石竹烯、氧化石竹烯、表藍(lán)桉醇。在頂空萃取和水蒸氣蒸餾中相對含有量都較高的成分有1，8-桉葉油素、蒿酮、蒿醇、樟腦、龍腦、4-甲基-1-(1-甲乙基)-3-環(huán)己烯-1-醇、石竹烯、氧化石竹烯。

3.4 在對指紋圖譜進(jìn)行相似度分析時(shí)，同文獻(xiàn)［6，10］遇到一樣的問題，儀器數(shù)據(jù)工作站導(dǎo)出的數(shù)據(jù)在用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)A版”與“中藥色譜圖分析和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)”分析時(shí)格式不能兼容。后來發(fā)現(xiàn)可以用“中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件”進(jìn)行處理。

3.5 本實(shí)驗(yàn)利用模式識別技術(shù)中的聚類分析對11批艾葉藥材中揮發(fā)性成分進(jìn)行研究。得到結(jié)果與通過相似度計(jì)算軟件計(jì)算結(jié)果一致，非常直觀，可與指紋圖譜相似度計(jì)算一起作為中藥質(zhì)量控制和品質(zhì)評價(jià)的科學(xué)依據(jù)。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:82，附錄63.

［2］梅全喜，高玉橋.艾葉化學(xué)及藥理研究進(jìn)展［J］.中成藥，2006，28(7):1030-1032.

［3］韓 軼，戴 璨，湯璐瑛.艾葉揮發(fā)油抗病毒作用的初步研究［J］.氨基酸和生物資源，2005，27(2):14-16.

［4］趙志鴻，黃勇勇，張小俊，等.河南駐馬店產(chǎn)艾葉揮發(fā)油的GC-MS分析［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):理學(xué)版，2013，45(2):80-84.

［5］陳 旭，曾建紅.廣西莪術(shù)揮發(fā)油的GC-MS特征成分及指紋圖譜研究［J］.藥物分析雜志，2008，28(8):1363-1366.

［6］張桂芝，張 立，孟慶華.姜黃飲片揮發(fā)油的GC-MS特征成分及指紋圖譜研究［J］.中成藥，2010，32(7):1092-1095.

［7］Zheng Xiaohua，Deng Chunhui，Song Guoxin，et al.Comparison of essential oil composition of Artemisia argi leaves at different collection times by headspace solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry［J］.Chromatographia，2004，59(6):729-732.

［8］Shen Shun，Sha Yunfei，Deng Chunhui，et al.Quality assessment of Flos Chrysanthemi Indici from different growing areas in China by solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry［J］.J Chromatogr A，2004，1047(2):281-287.

［9］林 霄，劉布鳴，柴 鳴，等.互葉白千層揮發(fā)油氣相指紋圖譜的化學(xué)模式識別研究［J］.香料香精化妝品，2012(6):10-13.

［10］張桂芝，朱佳麗，孟慶華.羌活飲片揮發(fā)油化學(xué)成分GCMS數(shù)字化指紋圖譜研究［J］.中成藥，2011，33(12):2034-2037.