戴海云，李七一，嚴士海

(1.南京中醫(yī)藥大學，江蘇南京 210000;2.江蘇省中醫(yī)院，江蘇南京 210029)

動脈粥樣硬化 (Atherosclerosis，AS)導致的心肌梗死、腦梗死以及冠心病等心腦血管疾病，在目前人類病死原因中占首位。機體過氧化損傷是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。南京中醫(yī)藥大學附屬江蘇省中醫(yī)院李七一教授臨床采用益氣養(yǎng)陰、活血化痰法治療冠心病心絞痛收到較好效果［1］。此后根據益氣養(yǎng)陰、活血化痰法自擬了冠心平方應用于臨床。在前期臨床及實驗研究中提示冠心平能調節(jié)血脂水平、保護血管內皮、改善心肌缺血，體外實驗證明冠心平含藥血清能減少細胞上清液中ET、MDA的水平，增加超氧化物歧化酶 (SOD)與一氧化氮合酶 (NOS)的活性，減低細胞凋亡率，減輕細胞線粒體膜電位的增加，降低NF-κB的表達增加［2］。本實驗在前期研究基礎上，觀察了冠心平對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型血清氧化應激與抗氧化指標超氧化物歧化酶 (SOD)、總抗氧化能力 (AOC)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽 (GSH)、氧化低密度脂蛋白 (ox-LDL)水平的影響，以進一步探討該方作用機制。

1 材料和方法

1.1 藥品和試劑 冠心平，由江蘇省中醫(yī)院藥劑科制備(批號110802);阿托伐他汀鈣片，由輝瑞制藥有限公司提供 (批號:084311K);苯磺酸氨氯地平，由輝瑞制藥有限公司提供 (批號1105113)。血清T-SOD測定試劑盒，由南京建成生物工程研究所提供 (批號20120530);血清GSH測定試劑盒，由南京建成生物工程研究所提供 (批號20120611);血清測定MDA試劑盒，由南京建成生物工程研究所提供 (批號20120529);血清T-AOC測定試劑盒，由南京建成生物工程研究所提供 (批號20120607)。

1.2 實驗動物 ApoE-/-小鼠，體質量 (20±2)g，雄性，由北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部提供，合格證號:SCXK(京)2006-0008。

1.3 分組 小鼠適應性飼養(yǎng)后，稱定質量，根據體質量隨機分組編號。將60只ApoE-/-小鼠隨機分成6組，每組10只，分別為空白組 (普通飼料)、模型組 (高脂飼料)、阿托伐他汀組 (6.67 mg/kg)、苯磺酸氨氯地平組 (1.67 mg/kg)、冠心平低劑量組 (0.75 g/kg)、冠心平高劑量組(1.5 g/kg)。各劑量組采用高脂飼料+藥物干預模式。

1.4 動物模型的建立 購買ApoE-/-小鼠，高脂飼料配料(78%基礎飼料、2%膽固醇、10%蛋黃粉、10%豬油配制)喂養(yǎng)12周，采血并做病理以確定模型成功。

1.5 實驗方法 正常組為基礎飼料喂養(yǎng)，其余組為高脂飼料飼養(yǎng)。除正常組與模型組外，冠心平低劑量組、冠心平高劑量組、阿托伐他汀組、苯磺酸氨氯地平組均高脂飼料喂養(yǎng)12周后，給予相應的藥物，正常對照組、模型組則于12周后給予等量蒸餾水灌胃。冠心平高低劑量組與阿托伐他汀組、苯磺酸氨氯地平組分別將藥物溶解于蒸餾水中灌胃，灌胃容積量按0.1 mL/10 g計算，每日1次，共1周。每周稱體質量1次，記錄體質量，末次給藥1 h后，眼眶采血，檢測相應指標。處死動物，取主動脈血管，液氮保存，備檢測。

1.6 觀測指標及測定方法

1.6.1 分光光度法與elisa法檢測血清中氧化性指標MDA等，抗氧化性指標SOD、AOC、GSH的水平，具體根據試劑說明書操作。

1.6.2 ox-LDL的檢測 提取血管組織蛋白，蛋白樣品處理后進行電泳，轉膜，染色，封閉，一抗二抗孵育，加發(fā)光液，曝光。保存顯示有目的條帶的膠片，以β-actin為內參照，應用圖象分析儀對條帶做掃描半定量。

1.7 數(shù)據統(tǒng)計 應用SPSS 15.0軟件包，資料數(shù)據均用均數(shù)±標準差 ()表示，數(shù)據先進行方差齊性檢驗，組間比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有顯著性意義，P＜0.01為差異有非常顯著性意義;定量分析主動脈粥樣硬化斑塊面積，使用的Image-Pro Plus軟件4.5(Media Cybernetics公司)。

2 實驗結果

2.1 冠心平對模型 3個月小鼠血清 T-SOD、T-AOC、MDA、GSH的影響 模型組小鼠血清 T-SOD、T-AOC、GSH的水平明顯降低，與正常組比較具有顯著性差異(P﹤0.01)。模型組小鼠血清MDA、ox-LDL的水平明顯升高，與正常組比較具有顯著性差異 (P﹤0.01)。冠心平低劑量與高劑量組小鼠血清T-SOD、T-AOC、GSH的水平比模型組明顯升高，與模型組比較具有顯著性差異 (P﹤0.05，P﹤0.01)。冠心平低劑量與高劑量組大鼠血清MDA、ox-LDL的水平比模型組明顯降低，與模型組比較具有顯著性差異 (P﹤0.01)。提示:冠心平具有升高ApoE-/-小鼠血清T-SOD、T-AOC、GSH的水平，降低血清MDA、ox-LDL水平的作用。見表1～2。

表1 各組3個月小鼠血清T-SOD、T-AOC、MDA、GSH的水平 (，n=10)

表1 各組3個月小鼠血清T-SOD、T-AOC、MDA、GSH的水平 (，n=10)

注:與正常組比較，△△P﹤0.01;與模型組比較，*P﹤0.05，＊＊P﹤0.01

組 別 T-SOD/(U·mL－1) T-AOC/(U·mL－1) MDA/(nmol·mL－1) GSH/(mg·L－1)96.68±4.58 2.89±0.6 22.64±5.04 13.28±5.82模型對照組 85.71±18.48△△ 1.54±0.59△△ 33.09±3.93△△ 5.09±2.07△△阿托伐他汀組 95.35±4.42* 2.21±0.58* 25±4.97＊＊ 10.73±4.08＊＊氨氯地平組 95.56±6.64＊＊ 2.31±0.56＊＊ 23.36±5.05＊＊ 12.06±4.63＊＊冠心平低劑量組 94.1 ±2.41＊＊ 2.09±0.56* 24.27±5.42＊＊ 10.34±4.16＊＊冠心平高劑量組 95.44±4.18＊＊ 2.52±0.76＊＊ 22.09±5.72＊＊ 11.95±5.27正常對照組＊＊

表2 各組3個月小鼠血清ox-LDL的水平 (，n=8)

表2 各組3個月小鼠血清ox-LDL的水平 (，n=8)

注:與正常組比較，△△P﹤0.01;與模型組比較，＊＊P﹤0.01

組 別 劑量/(g·kg－1) ox-LDL(μg/mL)1.24±0.44模型對照組 等量生理鹽水 5.71±1.27△△阿托伐他汀組 6.67×10－3 3.19±1.19＊＊氨氯地平組 1.67×10－3 4.13±0.72＊＊冠心平低劑量組 0.75 5.56±0.93冠心平高劑量組 1.5 2.88±1.12正常對照組 等量生理鹽水＊＊

2.2 冠心平對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型主動脈病理的影響 取主動脈血管用10%中性甲醛固定，石蠟包埋用于常規(guī)病理檢查。HE染色，見圖1～2。

HE染色顯示，正常組血管壁內膜清晰，無斑塊;模型組斑塊嚴重;冠心平組結果與阿托伐他汀組、氨氯地平組的斑塊明顯變小。

3 討論

動脈粥樣硬化 (Atherosclerosis，AS)導致的心肌梗死、腦梗死以及冠心病等心腦血管疾病，在目前人類病死原因中占首位。機體過氧化損傷是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。正常情況下，隨著氧化代謝效率的提高，體內的抗氧化能力也不斷增強，人體已經形成較為完善的抗氧化體系，即機體和細胞內活性氧的生成和清除處于一種動態(tài)平衡。當在某些因素的作用下這種平衡被打破，就形成了氧化應激?；钚匝踉谘懿∽?，尤其是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要的角色。氧化應激主要通過調節(jié)過氧化作用、誘導血管炎癥基因表達、促進局部炎癥反應和細胞增殖，多方面參與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。

圖1 冠心平對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型主動脈病理影響

圖2 主動脈動脈粥樣硬化病

人體內SOD以CuZnSOD為主，其含有量最高，是人體細胞抵御氧自由基損害的重要酶。研究證實，氧自由基介導的脂質過氧化損傷參與了動脈粥樣硬化形成和發(fā)展的病理過程［3］，氧自由基不僅氧化修飾低密度脂蛋白，促進泡沫細胞形成，而且還可以破壞血管內皮細胞，導致其功能障礙，從而促進動脈粥樣硬化發(fā)生。SOD是預防機體形成超氧陰離子自由基損害的主要活性酶，SOD活力增高，可對自由基清除增加，從而減輕對組織的氧化損傷和抑制LDL的氧化。血清中的T-AOC主要是血清中非酶促體系的抗氧化物質和酶促體系少數(shù)小分子量抗氧化物質的總和，是反映機體抗氧化作用的重要指標之一［4］。研究發(fā)現(xiàn)MDA、T-AOC是自由基損傷和酶促、非酶促系統(tǒng)清除氧自由基作用的敏感指標［5］。GSH是廣泛存在于生物體內的一種生物活性肽，是細胞內重要的還原劑，對過氧化物、自由基和親電子基起拮抗作用，能清除過氧化代謝產物，阻斷脂質過氧化反應，從而起到保護細胞膜結構和功能完整的作用［6］。MDA是脂質過氧化代謝的毒性終產物，其含量直接反映體內脂質過氧化的速率和強度，并可間接反映機體清除自由基的能力，自由基作用于脂質發(fā)生過氧化反應，氧化終產物為MDA，會引起蛋白質、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細胞毒性［7］。ox-LDL促進動脈粥樣硬化形成及進展的機制也非常復雜，例如:ox-LDL作用于血管內皮細胞，誘導其表達ox-LDL，增強其攝取ox-LDL的功能，并可誘導內皮細胞表達基質金屬蛋白酶、纖溶酶原激活物抑制劑-1等炎癥遞質［8］。血漿中低密度脂蛋白(LDL)和自由基代謝產物丙二醛 (MDA)在過氧化作用下，形成氧化修飾的低密度脂蛋白 (OX-LDL)及MDALDL，OX-LDL和MDA-LDL目前被認為是引起細胞內脂質聚集和泡沫形成的重要因素［9-11］。

冠心平由黃精、當歸、三七、瓜蔞皮、甘松組成，具有益氣養(yǎng)陰、活血祛瘀、化痰通絡、行氣止痛之功效。本方源自古方當歸補血湯(《蘭室秘藏》)加減。方中黃精與黃芪既補中益氣，又益精氣，潤心肺，補肝陰，為君藥;當歸養(yǎng)血活血、補中有行、補而不滯，三七活血化瘀通脈，兩味共為臣藥;瓜蔞皮寬胸化痰、開痹散結，為佐藥;甘松理氣止痛，與三七同入心經，可治“卒心腹痛滿”，同為使藥。全方藥物性味平和，攻補兼施，標本兼顧，補而不滯，攻而不峻，藥有側重，甚切冠心病氣陰兩虛、痰瘀互阻之病機。前期臨床研究冠心平能調節(jié)血脂水平、保護血管內皮、改善心肌缺血，體外實驗證明冠心平含藥血清能減少細胞上清液中ET、MDA的水平，增加超氧化物歧化酶 (SOD)與一氧化氮合酶 (NOS)的活性，減低細胞凋亡率，減輕細胞線粒體膜電位的增加，降低NF-κB的表達增加。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃精、三七、甘松、當歸均具有抗氧化作用［12-14］。

本研究通過實驗證實冠心平對高脂飼料飼喂致動脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠，具有升高血清T-SOD、T-AOC、GSH的水平，和降低血清MDA、ox-LDL水平的作用，證實其確實能夠有效地干預動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生、發(fā)展，降低心血管疾病的發(fā)生，為冠心平治療動脈粥樣硬化提供了實驗依據。

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