徐望龍，李云貴，孫林軍，唐勵(lì)靜，謝雁飛，郭 玉*

(1.南華大學(xué)藥物藥理研究所，湖南衡陽 421001;2.南華大學(xué)船山學(xué)院，湖南衡陽 421001;3.婁底市中心醫(yī)院，湖南婁底 417000)

山銀花Lonicerae Flos為忍冬科植物灰氈毛忍冬Lonicera macrathoides Hand.-Mazz.、紅腺忍冬 Lonicera hypoglauca Miq.、華南忍冬Lonicera confusa DC.或黃褐毛忍冬Lonicera fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng的干燥花蕾或帶初開的花［1］。忍冬科植物中的黃酮類化合物種類豐富［2］，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物具有廣泛的藥理作用，如抗腫瘤、抗炎癥、抗突變、抗過敏、降血脂等［3-4］。山銀花為臨床常用中藥，具有清熱解毒、涼散風(fēng)熱的功效，常用于治療癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒、溫病發(fā)熱等癥［5］，其黃酮化合物的抗氧化活性目前尚未見報(bào)道。本研究采用70%乙醇浸提與超聲波相結(jié)合的方法提取山銀花總黃酮，并采用清除O2－·、·OH和DPPH·的效果及對氧化損傷的內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，體外觀察山銀花中黃酮類化合物的抗氧化活性，為山銀花黃酮類化合物的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 新鮮山銀花采摘于湖南省邵陽市隆回縣，經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院鑒定。用蒸餾水洗凈置于60℃烘箱中干燥，粉碎、過40目藥篩，制得山銀花干粉，密封保存，備用。

1.1.2 試劑 蘆丁對照品 (批號100416-201004，中國食品藥品檢定研究院);鄰二氮菲 (分析純，大茂化學(xué)試劑廠)，鄰苯三酚 (分析純，博迪化工股份有限公司)，H2O2(分析純，西隴化工股份有限公司)，Tris(分析純，Aladdin Chemistry Co.Ltd)，DPPH(Purity，TCI)，DMSO(分析純，Amresco)，維生素 C(生物級，購于 Fluka公司);MTT(分析純，Aladdin Chemistry Co.Ltd)，其他試劑均為分析純。

1.1.3 儀器 UV-2540(日本島津公司);FA224型電子天平 (上海舜宇恒平科學(xué)儀器公司);SB-5200DTDN型超聲波清洗儀 (寧波新芝生物科技公司);FW100高速萬能粉碎機(jī) (天津市泰斯特儀器公司);BIO-TEK酶標(biāo)儀(ELX800，美國);SHZ-DⅢ型循環(huán)水真空泵 (予華儀器有限責(zé)任公司);RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (予華儀器有限責(zé)任公司);Freezer Dryer(FD5-2.5，Gold SIM International Group Co.Ltd);HYQ-3110渦旋混勻器 (Crystal Industries，America)。

1.2 方法

1.2.1 黃酮粗提取物的制備 稱取50.0 g山銀花粉末，浸于70%乙醇溶液中，先超聲 (60℃、200 W)提取5 min，再回流提取30 min，同法提取3次，合并3次提取液，減壓回收乙醇，濃縮至15 mL左右時(shí)移入提前稱好質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，冷凍干燥得到黃酮粗提取物，稱重，計(jì)算提取率。

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別取0.2 mg/mL蘆丁對照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于6只25 mL量瓶中，加入5%NaNO21.0 mL，搖勻，放置6 min后加入10%Al(NO3)3溶液1.0 mL和1.0 mol/L NaOH溶液10.0 mL，混勻，用蒸餾水稀釋至刻度，15 min后以第一管作空白參比，在510 nm波長處測定吸光值;以吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［6］。

1.2.3 山銀花黃酮定量測定 準(zhǔn)確稱取黃酮粗品100.0 mg，加入70%的乙醇溶液，搖勻，定容至100 mL，得到樣品液。精密吸取1.0 mL樣品液置于25 mL量瓶中，后續(xù)步驟同“1.2.2”項(xiàng)，測定吸光值;由回歸方程計(jì)算粗提物中黃酮的含有量。

在輪滑運(yùn)動(dòng)教學(xué)中，教師應(yīng)該指導(dǎo)學(xué)生學(xué)會正確的摔倒方式，使其在發(fā)生摔倒事件時(shí)能夠?qū)⑸眢w的損傷程度降到最低。輪滑教師要指導(dǎo)學(xué)生在摔倒時(shí)候應(yīng)該盡量保持冷靜，努力將自身的膝蓋先行著地，之后是手肘，最后是手掌，以此來減少身體與地面的接觸面積。在摔倒時(shí)候避免身體部位直接與地面接觸而產(chǎn)生嚴(yán)重的身體損傷，在向前摔倒時(shí)應(yīng)將頭部向后仰，向后摔倒時(shí)應(yīng)將頭部向前仰，盡量避免傷害到頭部。

1.3 抗氧化活性測定

1.3.1 山銀花黃酮粗提物對O－2·的清除作用 取質(zhì)量濃度為0、50、100、150、200、250 μg/mL黃酮粗提物溶液各2.0 mL，分別加4.5 mL Tris-HCl溶液 (0.05 mol/L，pH 8.2)和2.2 mL雙蒸水，室溫水浴20 min，再加鄰苯三酚溶液 (3.0 mmol/L)0.3 mL，迅速混勻于420 nm處測吸光值A(chǔ)，每30 s測1次，以雙蒸水調(diào)零，質(zhì)量濃度為0管用于計(jì)算鄰苯三酚溶液的自身氧化速率，計(jì)算O－2·清除能力［7］。

公式:清除率 (%)=(A0－A樣)/A0×100%。

其中:A0，樣品質(zhì)量濃度為0管的吸光值;A樣，樣品管的吸光值。

1.3.2 山銀花黃酮粗提物對·OH的清除作用 取2.0 mL鄰二氮菲溶液 (7.5 mmol/L)和4.0 mL磷酸緩沖液 (pH 7.4)7份 (1～7號)分別加入黃酮粗提物溶液 (0、0、50、100、150、200、250 μg/mL)2.0 mL，充分搖勻后加2.0 mL硫酸亞鐵(0.75 mmol/L)和2.0 mL H2O2(0.01%，其中1號0管以雙蒸水代替 H2O2)，搖勻，37℃水浴60 min后536 nm檢測吸光值A(chǔ)，并以雙蒸水調(diào)零。計(jì)算·OH的清除率［7］。

公式為:清除率 (%)=(A樣－A空)/(A0－A空) ×100%。

其中:A0，1號0管的吸光值;A樣，樣品管的吸光值;A空，2號0管的吸光值。

公式為:清除率 (%)=(A空－A樣)/A空×100%。

其中:A空，質(zhì)量濃度為0管的吸光值;A樣，樣品管的吸光值。

1.3.4 山銀花黃酮粗提物對內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞的抗氧化保護(hù)作用 用1.0 mmol/L H2O2與內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞共同孵育12 h復(fù)制氧化損傷模型，以維生素C為陽性抗氧化藥物，用MTT法篩選建立氧化損傷模型的H2O2最佳濃度和抗氧化損傷的維生素C最佳濃度，測定波長為490 nm。同理，用MTT法檢測不同質(zhì)量濃度山銀花黃酮粗提物預(yù)處理30 min對內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用［9，10］。

2 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線與回歸方程 蘆丁質(zhì)量濃度C與吸光值A(chǔ)的關(guān)系經(jīng)線性回歸分析，得回歸方程為A=0.2406C－0.1252，r=0.9991。說明蘆丁質(zhì)量濃度在8～40 μg/mL范圍內(nèi)線性良好。

3.2 山銀花黃酮粗提物的提取率與含有量 70%乙醇浸提結(jié)合超聲波法，從50.0 g山銀花粉末中提取得到總黃酮粗品質(zhì)量為2.8254 g，其提取率為5.65%;根據(jù)測定粗提物的吸光度值，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法，計(jì)算得到粗提物中總黃酮的含有量為16.35%。

3.3 山銀花黃酮粗提物抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 山銀花黃酮粗提物對·、·OH及DPPH·的清除效果

3.3.2 山銀花黃酮粗提物對內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞的抗氧化保護(hù)作用 內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞與濃度1.0 mmol/L的H2O2共同孵育12 h后，細(xì)胞的形態(tài)和活性明顯變化，其存活率分別下降到49.21%和61.32%。不同質(zhì)量濃度的黃酮粗提物對不同類型的細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用結(jié)果見表1。中、低質(zhì)量濃度對內(nèi)皮細(xì)胞有較強(qiáng)的抗氧化保護(hù)作用，而高質(zhì)量濃度黃酮保護(hù)作用不明顯，推測可能高質(zhì)量濃度黃酮對該細(xì)胞產(chǎn)生了一定的毒性。在心肌細(xì)胞中，黃酮對該細(xì)胞的抗氧化保護(hù)作用呈劑量依賴性，高質(zhì)量濃度組對心肌細(xì)胞的保護(hù)效果強(qiáng)于中質(zhì)量濃度組，且兩個(gè)質(zhì)量濃度都有顯著的保護(hù)作用，而低質(zhì)量濃度組保護(hù)作用不明顯。陽性對照組維生素C對內(nèi)皮細(xì)胞的抗氧化保護(hù)作用明顯高于保護(hù)效果最好的中質(zhì)量濃度黃酮組，而對心肌細(xì)胞的抗氧化保護(hù)作用同高質(zhì)量濃度的黃酮組相當(dāng)。

4 討論

黃酮是一類多酚類化合物，多具抗氧化活性，能直接清除機(jī)體的自由基，抑制還原型輔酶Ⅱ (NADPH)氧化酶的活性，抑制活性氧 (ROS)的產(chǎn)生，減少氧化應(yīng)激。研究表明，黃酮類化合物具有抗高血壓、抗癌、明顯降低心血管疾病的死亡率等［9-10］。目前，有文獻(xiàn)報(bào)道了忍冬科金銀花中黃酮類化合物的提取及抗氧化活性的研究，但是，對資源豐富的山銀花黃酮類化合物抗氧化活性的研究尚未見報(bào)道。謝學(xué)明等［11］的研究證實(shí)華南忍冬的乙醇提取物對DPPH·有很強(qiáng)的抗氧化活性。王柳萍等［12］對廣西紅腺忍冬和山東忍冬的總黃酮提取物的抗氧化作用進(jìn)行了研究，結(jié)果為山東忍冬的抗氧化活性比廣西紅腺忍冬的抗氧化活性較強(qiáng)，說明不同地區(qū)的忍冬科植物的總黃酮提取物的抗氧化能力也有差異。現(xiàn)代研究證實(shí)，忍冬科的金銀花黃酮類成分具有清除人體·、抗衰老、改善血管功能和提高機(jī)體免疫力等重要作用［13］;能抑制燙傷小鼠中性粒細(xì)胞釋放過氧化氫，減少中性粒細(xì)胞合成和釋放溶酶體酶［14］，對油脂的過氧化反應(yīng)也有明顯的抑制作用。

表1 山銀花黃酮粗提物對內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞的影響 (n=6)

山銀花也屬忍冬科植物，與金銀花極為相似，原材料來源卻極為廣泛。本實(shí)驗(yàn)以70%乙醇結(jié)合超聲波法提取山銀花總黃酮的操作程序簡單、方便、安全，提取效率高以及提取物保留著較高的生物學(xué)活性等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)觀察到山銀花黃酮具有較強(qiáng)的清除自由基能力，并且對氧化損傷的內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞具有較好的抗氧化保護(hù)作用。自由基的性質(zhì)活潑，氧化能力強(qiáng)，極易攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，并引發(fā)脂自由基過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受到不可逆性損傷，這可能是誘發(fā)多種疾病的發(fā)病機(jī)制［13，15］。研究報(bào)道，氧化損傷在血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起很重要的作用［15］，還導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、腫瘤等疾病的發(fā)生［16］。心血管疾病是全世界主要致死致殘的主要原因之一，且內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞氧化損傷是涉及心血管疾病的兩大主要因素。

山銀花黃酮類化合物抗氧化作用的研究還處于初級階段，尚未深入到分子機(jī)理水平，臨床運(yùn)用也僅作為一味中藥使用，黃酮類化合物在體內(nèi)的吸收和代謝規(guī)律等也有待進(jìn)一步研究。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:28.

［2］Shang X，Pan H，Li M，et al.Lonicera japonica Thunb.:ethnopharmacology，phytochemistry and pharmacology of an important traditional Chinese medicine［J］. J Ethnopharmacol，2011，138(1):1-21.

［3］McCullough M L，Peterson J J，Patel R，et al.Flavonoid intake and cardiovascular disease mortality in a prospective cohort of US adults［J］.Am J Clin Nutr，2012，95(2):454-464.

［4］Cai R L，Li M，Xie S H，et al.Antihypertensive effect of total flavone extracts from Puerariae Radix［J］.J Ethnopharmacol，2011，133(1):177-183.

［5］魯曉翔.黃酮類化合物抗氧化作用機(jī)制研究進(jìn)展［J］.食品研究與開發(fā)，2012，33(3):220.

［6］江慧華，劉俊劭，陳培珍.竹葉中黃酮提取分離及抗氧化活性研究［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，51(23):0439-8114.

［7］李仁偉，何鍵東，徐 青.海蘆筍黃酮類化合物抗氧化活性研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(28):13989-13992.

［8］Ilahi I，Samar S，Kham I，et al.In vitro antioxidant activities of four medicinal plants on the basis of DPPH free radical scavenging［J］.Pak J Pharm Sci，2013，26(5):949-952.

［9］Zhai L，Zhang P，Sun RY，et al.Cytoprotective effects of CSTMP，a novel stilbene derivative，against H2O2-induced oxidative stress in human endothelial cells［J］.Pharmacol Rep，2011，63(6):1469-1480.

［10］Gaascht F，Dicato M，Diederich M.Venus flytrap(Dionaea muscipula Solander ex Ellis)contains powerful compounds that prevent and cure cancer［J］.Front Oncol，2013，3:202.

［11］謝學(xué)明，鐘遠(yuǎn)聲，李熙燦，等.中華南地產(chǎn)藥材的抗氧化活性研究［J］.中藥藥理與臨床，2006，22(1):48.

［12］王柳萍，辛 寧，丘 岳，等.廣西紅腺忍冬與山東忍冬總黃酮提取物的抗氧化作用研究［J］.廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，27(5):681-683.

［13］Weseler A R，Bast A.Curr Hypertens Rep.Oxidative stress and vascular function:implications for pharmacologic treatments［J］.Curr Hypertens Rep，2010 ，12(3):154-161.

［14］韓 樹.忍冬莖葉化學(xué)成分及其抑菌活性的研究［D］.西北林業(yè)科技大學(xué)，2008.

［15］Majewska-Wierzbicka M，Czeczot H.Flavonoids in the prevention and treatment of cardiovascular diseases［J］.Pol Merkur Lekarski，2012，32(187):50-54.

［16］Duthie G，Morrice P.Antioxidant capacity of flavonoids in hepatic microsomes is not reflected by antioxidant effects in vivo［J］.Oxid Med Cell Longev，2012，2012:165127.