潘 樂，李立青，徐 強

(黃山學院化學化工學院，安徽黃山 245041)

水蜈蚣Kyllinga Brevifolia Rottb，又稱金鈕草、水金釵、散寒草，是莎草科水蜈蚣屬多年生草本植物?！睹耖g常用草藥匯編》稱其能“散風，除陳寒，止咳嗽”，中醫(yī)和臨床應用研究表明其功能主治為疏風、清熱、活血、解毒、發(fā)熱、百日咳、毒蛇咬傷、風濕性關節(jié)炎和跌打損傷等［1-3］，這些功效與水蜈蚣的化學成分密切有關。目前，研究已發(fā)現(xiàn)水蜈蚣中存在著揮發(fā)油、黃酮類化合物、酚類化合物等化學成分［4-6］。多酚類化合物具備抗氧化、清除自由基、抗癌抗腫瘤、防治心腦血管疾病等特性，是一種重要的生物活性物質［7］。但迄今為止，對水蜈蚣多酚提取的研究仍然較少，僅有賢景春等［6］采用正交設計對乙醇浸提水蜈蚣多酚進行了研究。

由于超聲具有空化、粉碎、攪拌等特殊作用，因此超聲提取法與傳統(tǒng)的熱提取法和浸泡提取法相比較，具備提取時間短、操作便捷、產率高、無需加熱等優(yōu)點，已廣泛應用于天然植物中多酚的提?。?-9］?？紤]到正交設計的局限性，本實驗利用Box-Benhnken設計原理［10-11］，采用效應面優(yōu)化法對超聲提取水蜈蚣多酚工藝進行探索，優(yōu)化和確定了最佳提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 水蜈蚣，購于黃山市徽州醫(yī)藥有限責任公司，由黃山學院生命與環(huán)境學院汪立祥副教授鑒定，40℃下烘干12 h，粉碎后置于干燥器中保存;沒食子酸對照品，中國食品藥品檢定研究院，批號110831- 201004;三氯化鐵、無水乙醇、鐵氰化鉀、鹽酸等均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司;水為超純水。

電子分析天平 (梅特勒-托利多儀器 (上海)有限公司);循環(huán)水真空泵 (河南鞏義市英峪予華儀器廠);KQ-200VDB型超聲波清洗器 (昆山超聲儀器有限公司);UV-2200型紫外可見分光光度計 (日本島津公司);JJ-2型小型組織粉碎機 (萬州江東機械廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1 沒食子酸對照品溶液的配制 準確稱取50 mg沒食子酸對照品，置于100 mL的棕色量瓶中，加水溶解并定容至100 mL，搖勻。精密量取10 mL置于100 mL棕色量瓶中，用水稀釋并定容至刻度，搖勻，得到質量濃度為0.05 mg/mL的沒食子酸對照品，備用。

1.2.2 沒食子酸標準曲線的繪制［12］分別精密移取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL配置好的沒食子酸對照品溶液，分別置于6個50 mL量瓶中，每個量瓶中依次加入0.100 mol/L三氯化鐵、0.008mol/L鐵氰化鉀和0.100 mol/L的鹽酸溶液各1.00 mL，以水定容至刻度，靜置15 min。以未加入沒食子酸對照品的樣品為試劑空白，在705 nm處測定吸光值，并繪制標準曲線。

1.2.3 樣品的提取 精密稱取1 g水蜈蚣樣品粉末，置于250 mL錐形瓶中。按一定的料液比 (1∶10～1∶35 g/mL)加入不同體積分數的乙醇溶劑 (30%～80%)，超聲提取一定時間 (15～40 min)，抽濾得濾液，轉移至100 mL量瓶，用同體積分數的乙醇提取劑定容至刻度。精密吸收10 mL，置于100 mL棕色量瓶中，加水定容，搖勻，即得樣品溶液。

1.2.4 多酚的測定 精密量取1 mL樣品溶液，按照“1.2.2”項標準曲線測定方法，測定其吸光值。根據標準回歸方程得到樣品溶液中總多酚的濃度，計算水蜈蚣樣品中多酚提取率。

1.2.5 水蜈蚣多酚提取的單因素試驗 分別以料液比、提取時間、乙醇體積分數為變量，研究其對水蜈蚣多酚提取率的影響。

1.2.6 效應面對提取工藝的優(yōu)化 綜合單因素試驗結果，根據Box-Benhnken設計原理，采用效應面優(yōu)化法對水蜈蚣多酚工藝進行優(yōu)化。

2 結果與討論

2.1 沒食子酸標準曲線 按“1.2.2”項的實驗方法，測定的標準曲線回歸方程為 y=114.6x+0.0177，r2=0.9997，表明方程線性關系良好。

2.2 單因素試驗 單因素水平結果如圖1～3所示，由圖可知，超聲提取水蜈蚣多酚各單因素最佳提取條件為提取時間30 min，乙醇體積分數為60%，料液比為1∶25。

圖1 提取時間對提取率的影響

圖2 乙醇體積分數對提取率的影響

圖3 料液比對提取率的影響

2.3 Box-Behnken實驗設計及結果 在單因素試驗結果的基礎上，根據Box-Benhnken的設計原理，采用3因素3水平進行效應面分析。每因素設3水平，分別用代碼－1、0、1來表示。代碼值所代表的實際操作物理量，如表1。

表1 效應面分析因素和水平

按表1的分析因素和水平，利用Design-Expert 8.0.3軟件進行實驗設計，共設計17個實驗點，對每個實驗點進行測定，得到實際結果如表2。

表2 效應面實驗設計與結果

2.4 模型的建立及分析 利用Design-Expert 8.0.3軟件將表2實驗數據進行效應面分析:以多酚提取率 (Y)為效應值，分別對乙醇體積分數 (A)，料液比 (B)，提取時間(C)3個因素進行多元回歸擬合，發(fā)現(xiàn)用二次階多項式回歸最優(yōu)，軟件得到的回歸方程如下:

二次多項式回歸方程:Y=5.76－0.00625A+0.26B+0.15C－0.18AB+0.11AC+0.053BC－0.36A2－0.17B2－0.30C2(r2=0.9142)

多元線性回歸方程:Y=5.37－0.00625A+0.26B+0.15C(r2=0.3504)

比較R2的大小，發(fā)現(xiàn)二次多項式回歸方程擬合明顯優(yōu)于多元線性擬合，刪除其中t檢驗不顯著項，將二項式方程簡化為:

Y=5.76+0.26B+0.15C－0.18AB+0.11AC－0.36A2－0.17B2－0.30C2(r2=0.9841)

對擬合方程進行方差分析見表3。比較表3中各因素的P值可以看出乙醇體積分數、料液比、提取時間3個因素對多酚提取率都有極顯著的影響;回歸方程失擬檢驗不顯著，說明影響提取的其他一些未知因素對試驗干擾較小。因此，該方程較好地描述了總酚提取率隨各個因素的變化規(guī)律，具備較好的預測指導性。

表3 回歸模型方差分析結果

2.5 提取工藝的優(yōu)化和預測 比較表3中AB、BC、AC這3組交互因素的P值，以AB的相互作用影響最大。利用Design-Expert 8.0.3軟件繪制多酚提取率 (Y)與相互作用最顯著的兩個自變量AB、BC、AC的三維效應曲線面和等高線，如圖4～6所示。利用回歸模型，對模型方程求一階偏導可以得到模型的最佳提取條件為:料液比為11∶25.99，提取時間為 30.31min，乙醇體積分數為58.3772%，水蜈蚣多酚的理論提取率為5.81 mg/g。

2.6 驗證試驗 根據預測的最優(yōu)提取條件，考慮到實驗的方便，將提取最佳條件修正為料液比為11∶26，提取時間為30 min，乙醇體積分數為58%，平行實驗3次，多酚提取率分別為5.82、5.79、5.80 mg/g，平均值為5.80 mg/g，RSD為1.72%。表明所建立的數學模型具備精確的預測性，所選的工藝條件具有良好的重復性。

圖4 因素AB相互作用對提取率的三維效應曲線面和二維等高線曲線圖

圖5 因素BC相互作用對提取率的三維效應曲線面和二維等高線曲線圖

與文獻［6］中乙醇浸提法1.5 h的提取時間相比，超聲提取法僅需30 min，耗時明顯縮短，單位時間提取次數提高了2倍;同時超聲提取法5.80 mg/g的產率相比乙醇浸提法5.09 mg/g的產率，有13.95%的提高。綜合考慮單位時間提取次數和提取產率兩個因素，超聲提取工藝的提取效率明顯高于乙醇浸提工藝。

3 結論

圖6 因素AC相互作用對提取率的三維效應曲線面和二維等高線曲線圖

天然植物中有效成分的提取工藝，較多的是采用正交設計實驗，而利用Box-Behnken原理進行方案設計，發(fā)揮計算機軟件Design-Expert功能強大的特性，可以得到更為精確的數學模型。本實驗對影響水蜈蚣多酚超聲提取的因素進行了探討，確立水蜈蚣多酚的超聲提取工藝為:料液比為1∶26，提取時間為30 min，乙醇體積分數為58%，提取總多酚產率為5.80 mg/g。由于實驗采用了Box-Behnken效應面法進行擬合，充分考慮了各因素之間的相互作用，提高了實驗準確性和預測性，能更好地指導工藝。同時與乙醇浸提方法相比，超聲提取法在單位時間內的提取次數和提取產率更高。本實驗為傳統(tǒng)中草藥水蜈蚣的超聲提取工藝提供了準確的實驗數據，有助于水蜈蚣在現(xiàn)代中藥產業(yè)中的進一步開發(fā)和利用。

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