肖 艷 甘南琴 鄭凌凌 宋立榮

(1. 中國(guó)科學(xué)院重慶綠色智能技術(shù)研究院, 三峽生態(tài)環(huán)境研究所, 重慶 401122; 2. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 武漢 430072)

在富營(yíng)養(yǎng)化湖泊中, 藍(lán)藻水華的頻繁暴發(fā)引起水生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的損害, 并對(duì)人類健康造成潛在威脅[1]。其中, 微囊藻常在我國(guó)大多數(shù)的淺水湖泊中聚積成很大的群體并形成有害水華。通常在培養(yǎng)條件下, 微囊藻以單細(xì)胞形式存在, 而在自然條件下主要是以群體形式存在[2]。許多研究認(rèn)為, 這種表型可塑性, 即一種基因型在不同的環(huán)境條件下呈現(xiàn)出多種表型的現(xiàn)象, 是對(duì)環(huán)境的適應(yīng)。這種適應(yīng)使得微囊藻更能應(yīng)對(duì)和抵御外界環(huán)境的變化, 從而形成了極強(qiáng)的生態(tài)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì), 如群體微囊藻對(duì)低磷的耐受能力比單細(xì)胞微囊藻強(qiáng)[3], 并具有高效的無(wú)機(jī)碳吸收能力[4,5], 抗高光強(qiáng)輻射和Cu脅迫的能力[6,7],較快的遷移速率[8], 且能更好地抵御捕食壓力[9]。

目前研究認(rèn)為, 環(huán)境條件的變化導(dǎo)致了藻類形態(tài)的改變。因此, 要了解這種形態(tài)改變的機(jī)制, 也就需要了解外界各種環(huán)境因素對(duì)藻類的影響。已有研究表明環(huán)境中的非生物因子, 如光照、溫度、pH、微量元素、微囊藻毒素(Microcystins, MCs)等[10—13],及生物因素, 如細(xì)菌、浮游動(dòng)物等[14,15]都能對(duì)浮游植物的形態(tài)產(chǎn)生影響。光是所有光合自養(yǎng)生物的重要資源, 它的可利用性可以影響種群結(jié)構(gòu)[16]。Naselli-Flores, et al.[17]也指出在富營(yíng)養(yǎng)化水體中,光照是浮游植物形成聚集體的重要因素。

目前有關(guān)光照對(duì)微囊藻形態(tài)影響的研究相對(duì)較少, 且一般都建立在單細(xì)胞形態(tài)的基礎(chǔ)之上, 已有研究表明單細(xì)胞和群體微囊藻在生理參數(shù)及對(duì)脅迫的響應(yīng)上具有明顯的差異[3,18]。深入研究微囊藻水華形成及優(yōu)勢(shì)維持, 對(duì)微囊藻群體的研究尤顯重要。基于此背景, 本研究選取 6株不同種的群體微囊藻, 深入探討光強(qiáng)對(duì)群體微囊藻的形態(tài)、群體大小的影響及其生理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藻種及培養(yǎng)條件

實(shí)驗(yàn)選用的群體微囊藻相關(guān)信息見(jiàn)表 1。Microcystis flos-aquae FACHB1174和M. sp. FACHB1027取自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)(FACHB-collection); M. wesenbergii DC-M1、M.viridis DC-M2、M. aeruginosa TH-M2 和 M.aeruginosa DH-M1分別分離自滇池(DC)、太湖(TH)和東湖(DH), 在顯微鏡下挑取單克隆, 無(wú)菌純化培養(yǎng), 并保存于中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)。這 6株微囊藻都保持群體形態(tài), 直徑大小100—600 μm不等。常規(guī)培養(yǎng)以BG11為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,培養(yǎng)溫度(25±1)℃, 光照強(qiáng)度 25 μmol/(m2·s), 光周期 12h︰12h。當(dāng)藻培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí), 離心后加入新鮮的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入250 mL三角瓶中, 放在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的光強(qiáng)梯度 0、10、25、80、120 和 200 μmol/(m2·s)下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)周期為 15d, 光強(qiáng) 25 μmol/(m2·s)為對(duì)照組。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用群體微囊藻藻株Tab. 1 Strains of colonial Microcystis used in this study

1.2 群體大小的測(cè)定

微囊藻的群體大小通過(guò)裝有數(shù)碼相機(jī)(Olympus DP 71)的顯微鏡拍照測(cè)定(Olympus BX 51, Japan)。隨機(jī)取樣 50個(gè)群體微囊藻, 在圖片測(cè)量分析軟件Olympus DP-Soft中量取單個(gè)群體微囊藻的面積(S)、長(zhǎng)(l)、寬(d)等指標(biāo), 通過(guò)公式換算成近似球體直徑(即群體直徑)[19,20], 并求平均值。

1.3 比生長(zhǎng)速率的測(cè)定

采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法每3天測(cè)定一次生物量。生長(zhǎng)速率根據(jù)一定時(shí)間內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的變化來(lái)計(jì)算[21]。群體微囊藻用超聲波打散為單細(xì)胞再進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),超聲功率100W, 超聲時(shí)間3s, 間隔3s, 全程1min。

1.4 胞外及膠被多糖的測(cè)定

每3天取不同光強(qiáng)條件下的藻樣, 8000 r/min離心10min (Eppendorf, 5804R, Germany), 上清液進(jìn)行溶解性胞外多糖的測(cè)定。藻細(xì)胞沉淀重懸于等體積的超純水中, 50℃水浴加熱并不斷攪拌30min, 離心取上清進(jìn)行膠被多糖含量的測(cè)定[22]。多糖含量與細(xì)胞數(shù)的比值可定義為單位生物量?jī)?nèi)多糖的含量。

1.5 微囊藻毒素合成酶基因(mcy)表達(dá)的檢測(cè)

取群體微囊藻樣品 20 mL, 8000 r/min離心10min收集藻細(xì)胞?？俁NA的提取使用Trizol試劑盒(Invitrogen, USA)。RNA純化使用RNeasy試劑盒(QIAGEN, Hilden, Germany)。隨后通過(guò)電泳檢測(cè)RNA的完整性, 測(cè)定 A280、A260判斷其質(zhì)量, 檢測(cè)RNA濃度(Nano-drop Technologies, Wilmington, DE,USA)并稀釋一致。

純化并稀釋后的總 RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen, USA)以隨機(jī)引物oligo(dT)18進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA作為模板, 用特異的基因引物[23]進(jìn)行PCR反應(yīng)檢測(cè)基因的轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)條件如下:20 μL反應(yīng)體系中含有 2 μL 10倍緩沖液, 0.2 μL dNTP, 0.2 μL Taq DNA polymerase, 引物各 0.5 μL,1.5 μL cDNA, 15.1 μL ddH2O。反應(yīng)經(jīng) 94°C 5min 變性后, 進(jìn)行 32個(gè)循環(huán): 94℃ 30s, 55℃ 30s, 72℃30s, 最后在72℃延伸5min。使用Mastercycler pro(Eppendorf, Germany) PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物在1.4%瓊脂糖凝膠電泳檢查。選用16S rRNA作為內(nèi)參, 因?yàn)?16S rRNA基因在不同環(huán)境條件下表達(dá)都相對(duì)穩(wěn)定[24]。

1.6 胞內(nèi)微囊藻毒素含量的測(cè)定

取藻樣30 mL, 經(jīng)0.45 μm醋酸纖維濾膜抽濾后冷凍干燥處理。將藻樣(包括濾膜)用75%甲醇提取3次后合并提取液(最后約100 mL)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮去除甲醇(最后體積約 10 mL), 然后將濃縮提取液用SPE柱濃縮富集、洗滌、洗脫, 最后定容至1 mL, 高速離心(12000 r/min, 10min)后, 在高壓液相色譜儀(High-Performance Liquid Chromatography, HPLC)上進(jìn)行測(cè)定[25]。毒素含量與細(xì)胞數(shù)的比值可定義為單位生物量?jī)?nèi)毒素的含量。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次, 數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。數(shù)據(jù)分析采用 Origin Version 8.0 (Origin Lab Corporation, USA)方差分析和組間差異顯著性檢驗(yàn)(One-way ANOVA), 當(dāng)P<0.05時(shí), 處理組與對(duì)照組間存在顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 不同光強(qiáng)對(duì)微囊藻群體大小的影響

對(duì)不同光強(qiáng)下群體大小測(cè)定的結(jié)果顯示(圖 1),當(dāng)光強(qiáng)為 80—200 μmol/(m2·s)時(shí), 6 株微囊藻群體直徑顯著增加(P<0.05)。在 200 μmol/(m2·s)的光照條件下, 微囊藻的群體直徑最大, DH-M1、DC-M2、TH-M2、DC-M1、FACHB1174和FACHB1027的群體直徑比對(duì)照組分別增大了2.4、1.8、1.9、1.7、1.9和 3.9倍。在光強(qiáng)低于25 μmol/(m2·s)及黑暗條件下,6株微囊藻的群體直徑略有減小。

圖1 不同光強(qiáng)下微囊藻群體大小的變化Fig. 1 Change of size of Microcystis colonies at different light intensities

2.2 不同光強(qiáng)對(duì)群體微囊藻比生長(zhǎng)速率的影響

結(jié)果表明, 當(dāng)光強(qiáng)在 80 μmol/(m2·s)以下時(shí), 6株群體微囊藻的生長(zhǎng)速率隨著光強(qiáng)增加而穩(wěn)定增大。在光強(qiáng)為 80—200 μmol/(m2·s)時(shí), TH-M2、DC-M1、FACHB1174和FACHB1027這4株群體微囊藻, 生長(zhǎng)速率變化無(wú)顯著性差異(P>0.05); 而 DH-M1和DC-M2在高光強(qiáng)下比生長(zhǎng)速率顯著增大(P<0.05),在光強(qiáng)為 200 μmol/(m2·s)時(shí)生長(zhǎng)最快, 生長(zhǎng)速率分別達(dá)到0.22/d和0.19/d。此外, 在黑暗條件下, 6株群體微囊藻的生長(zhǎng)都受到抑制(圖2)。

2.3 不同光強(qiáng)對(duì)群體微囊藻胞外及膠被多糖含量的影響

群體微囊藻 TH-M2、DC-M1、FACHB1174和FACHB1027 在高光強(qiáng) 120 和 200 μmol/(m2·s)下的胞外多糖含量顯著高于 25—80 μmol/(m2·s)的處理組含量(P<0.05), 在 200 μmol/( m2·s)條件下, 單位生物量胞外多糖含量比對(duì)照組(25 μmol/(m2·s))分別增加了 2、1.9、2、2.4 倍。而另 2 株微囊藻 DH-M1、DC-M2在光強(qiáng)為 25—200 μmol/(m2·s)時(shí), 單位細(xì)胞胞外多糖含量變化無(wú)顯著性差異(P>0.05), 保持在較低水平(圖 3A)。與此同時(shí), 膠被多糖含量的變化與胞外多糖含量的變化呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)(圖3B)。

2.4 不同光強(qiáng)對(duì)群體微囊藻毒素合成酶基因(mcy)表達(dá)含量的影響

圖2 不同光強(qiáng)下群體微囊藻的比生長(zhǎng)速率Fig. 2 The specific growth rates of Microcystis at varying light intensities

在24h內(nèi), 3株群體微囊藻在不同光強(qiáng)條件下的mcyB和mcyD轉(zhuǎn)錄水平已有明顯變化。隨著光照的增加, TH-M2的mcyB的轉(zhuǎn)錄水平無(wú)明顯差異,而 mcyD的水平在高光強(qiáng)下升高。另兩株DC-M2、FACHB1027的mcyB和mcyD轉(zhuǎn)錄水平都有明顯上升。光照越強(qiáng), mcyB和mcyD的轉(zhuǎn)錄水平越高, 在 200 μmol/(m2·s)時(shí)達(dá)到最大(圖 4)。

2.5 不同光強(qiáng)對(duì)群體微囊藻胞內(nèi)毒素含量的影響

實(shí)驗(yàn)所用的 6株群體微囊藻除 M. wesenbergii DC-M1外, 其余 5株微囊藻經(jīng)檢測(cè)都產(chǎn)毒。在實(shí)驗(yàn)后期, 對(duì)這5株產(chǎn)毒的群體微囊藻胞內(nèi)毒素含量進(jìn)行檢測(cè), 結(jié)果表明, 隨著光強(qiáng)的增強(qiáng), 群體微囊藻單位生物量的胞內(nèi)毒素含量明顯增加(圖 5)。當(dāng)黑暗和光強(qiáng)為 10—25 μmol/(m2·s)時(shí), 5株產(chǎn)毒群體微囊藻單位細(xì)胞的胞內(nèi)毒素含量保持在較低水平, 毒素含量增加不明顯(P>0.05)。而當(dāng)光強(qiáng)為 80—200 μmol/(m2·s)時(shí), 微囊藻單位細(xì)胞毒素含量顯著上升(P<0.05), 其中當(dāng)光強(qiáng)為 200 μmol/(m2·s)時(shí), DH- M1、DC-M2、TH-M2、FACHB1174和FACHB 1027單位細(xì)胞毒素含量與對(duì)照相比分別上升了 48.82%、30.55%、74.01%、61.51%、60.82%。

3 討論

浮游植物可能產(chǎn)生不同的基因型或表型來(lái)應(yīng)對(duì)外界環(huán)境的變化。改變自身形態(tài)形成群體或集聚是最常見(jiàn)的一種形式。O’Farrell, et al.[26]的研究證實(shí), 在野外水體中, 光限制的水層, 單細(xì)胞、無(wú)鞭毛及小群體浮游生物較多, 而有鞭毛和大群體的浮游生物常聚集在光照充足的水層。Naselli-Flores & Barone[27]的報(bào)道也提出,在地中海水庫(kù)的不同水層中, 浮游植物形態(tài)和大小與其在水柱所接受的光強(qiáng)有密切關(guān)系。這些野外調(diào)查研究表明, 光強(qiáng)對(duì)藻類的形態(tài)建成有重要的影響, 然而這種影響過(guò)程及機(jī)制仍然缺乏充分的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。Walsby, et al.[28]曾提出當(dāng)微囊藻在高光強(qiáng)下培養(yǎng)時(shí), 細(xì)胞平均體積比在低光強(qiáng)下時(shí)增大了兩倍, 但是有關(guān)其變化機(jī)理并未闡明。此外, 對(duì)于微囊藻不同種/株系之間其形態(tài)變化對(duì)光強(qiáng)的響應(yīng)是否有差別也需要進(jìn)一步的探析。本研究以6株不同種的群體微囊藻為實(shí)驗(yàn)材料, 對(duì)其在不同光強(qiáng)處理下的形態(tài)進(jìn)行觀察及群體大小進(jìn)行測(cè)量, 結(jié)果表明, 在高光強(qiáng)條件培養(yǎng)下的微囊藻群體直徑顯著增大, 且不同種/株系的微囊藻其響應(yīng)機(jī)理有明顯的差異。

圖3 第15天不同光強(qiáng)下群體微囊藻的胞外多糖(A)和膠被多糖(B)含量Fig. 3 Contents of soluble extracellular polysaccharide (A) and bound extracellular polysaccharide (B) of Microcystis cultured under different light intensities on the 15th day

圖4 不同光強(qiáng)下群體微囊藻12h、24h內(nèi)mcy轉(zhuǎn)錄水平Fig. 4 Transcript levels of mcy in Microcystis under different light intensities in the 12h and 24h, respectively

圖5 第15天不同光強(qiáng)下群體微囊藻的胞內(nèi)毒素含量Fig. 5 Intracellular microcystins content of Microcystis cultured under different light intensities on the 15th day

3.1 胞外多糖和生長(zhǎng)對(duì)微囊藻群體大小的影響

胞外多糖是群體形成的物質(zhì)基礎(chǔ), 群體微囊藻的細(xì)胞外包裹著多糖黏液層, 同時(shí)藻細(xì)胞的聚集需要一定量的胞外多糖才能維持[29]。與解聚成單細(xì)胞的微囊藻相比, 群體微囊藻的溶解性胞外多糖、膠被多糖及總糖含量更高[30]。許多研究表明, 脅迫條件可以引起微囊藻光合產(chǎn)物 EPS (Extracellular polysaccharides)和酸性多糖的產(chǎn)生和釋放, 如浮游動(dòng)物的捕食、高濃度的鈣、毒素等[9,11,13], 從而導(dǎo)致了微囊藻群體的形成。而Zhang & Kojima[31]在對(duì)布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)的研究中也發(fā)現(xiàn), 隨著光強(qiáng)的減弱, 藻細(xì)胞分泌的胞外多糖含量下降,群體尺寸變小。本研究表明, 與對(duì)照組相比, 群體微囊藻TH-M2、DC-M1、FACHB1174和FACHB1027在高光強(qiáng)下單位生物量的胞外多糖及膠被多糖含量都顯著升高, 這為誘發(fā)藻細(xì)胞之間的黏合聚積成大群體提供了可能。而另2株微囊藻DH-M1和DC-M2在高光強(qiáng)下的胞外及膠被多糖含量雖然有所提高,但增加的并不顯著。Egan & Trainor[32]發(fā)現(xiàn)藻密度也能影響藻類的形態(tài), 低的藻密度有利于單細(xì)胞柵藻(Scenedesmus)的產(chǎn)生, 而高濃度有利于群體的形成。對(duì)這6株群體微囊藻的生長(zhǎng)速率的測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn), DH-M1和DC-M2即使在高光強(qiáng)下, 生長(zhǎng)速率仍然很高, 當(dāng)光強(qiáng)為 200 μmol/(m2·s)時(shí), 藻細(xì)胞密度最大。而另4株微囊藻在80—200 μmol/(m2·s)光強(qiáng)范圍內(nèi), 生長(zhǎng)速率無(wú)明顯差異。此外,在前期實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn), DH-M1和 DC-M2比另4株微囊藻具有更高的光飽和點(diǎn), 且在高光強(qiáng)下具有更強(qiáng)的光合活性[8], 這說(shuō)明DH-M1和DC-M2更耐受高的光強(qiáng), 另4株微囊藻在高光強(qiáng)下生長(zhǎng)受到脅迫。

Potts[33]認(rèn)為, 藻類分泌大量的EPS并不是浪費(fèi), 而是一種生理策略上的進(jìn)化,使其具有更強(qiáng)的適應(yīng)性, 能更好的生長(zhǎng)和生存, 尤其是在不利的環(huán)境條件下, 這種策略更顯優(yōu)勢(shì)。由此可推測(cè), TH-M2、DC-M1、FACHB1174和FACHB1027這4株微囊藻在高光強(qiáng)下通過(guò)分泌大量的 EPS, 使群體尺寸變大, 以形成更大的群體適應(yīng)高光強(qiáng)的環(huán)境,而 DH-M1和 DC-M2由于在高光強(qiáng)下藻密度最大,是通過(guò)生長(zhǎng)來(lái)促進(jìn)群體尺寸的增加。后續(xù)的研究結(jié)果也證實(shí)了, TH-M2、DC-M1、FACHB1174和FACHB1027這4株微囊藻增大群體尺寸, 細(xì)胞聚集緊密且分泌較多的 EPS, 是為了快速下沉躲避高光強(qiáng)的傷害; DH-M1和DC-M2增大群體尺寸, 加快生長(zhǎng)使其結(jié)構(gòu)較松散以減小細(xì)胞密度快速上浮至液面表層[8]。

3.2 微囊藻毒素對(duì)微囊藻群體大小的影響

此外, 已有的研究指出, 高濃度的MCs能促進(jìn)微囊藻細(xì)胞的聚集[12]。而微囊藻的產(chǎn)毒是通過(guò) mcy基因簇來(lái)調(diào)控的。Schatz, et al.[34]研究發(fā)現(xiàn), 無(wú)論是程序性死亡還是受到各種脅迫所引起的微囊藻細(xì)胞裂解, 其后釋放的MCs能誘導(dǎo)其余的微囊藻McyB蛋白的大量積累, 從而促進(jìn)這部分微囊藻MCs的產(chǎn)生。Kaebernick, et al.[23]以不同光強(qiáng)和光質(zhì)處理微囊藻, 用RNase保護(hù)試驗(yàn)檢測(cè)mcyB和mcyD的轉(zhuǎn)錄水平, 發(fā)現(xiàn)強(qiáng)光使mcyB和mcyD的轉(zhuǎn)錄水平升高, 這與本研究的結(jié)果是一致的, 高光強(qiáng)可通過(guò) mcy基因簇的調(diào)控對(duì)MCs的產(chǎn)生有顯著影響, 說(shuō)明光照的影響可從基因轉(zhuǎn)錄的水平得到實(shí)現(xiàn)。

光對(duì)于MCs合成十分重要。Utkilen & Gj?lme[35]研究發(fā)現(xiàn), 在M. aeruginosa的連續(xù)培養(yǎng)體系中, 光強(qiáng)與毒素產(chǎn)生具有顯著相關(guān)性, 光強(qiáng)升高時(shí)毒素含量增加, 而高于一定光強(qiáng)時(shí)毒素形成能力下降。Wiedner, et al.[36]也認(rèn)為, 微囊藻PCC7806的毒素含量與光照強(qiáng)度成正相關(guān)關(guān)系。通過(guò)HPLC方法測(cè)定不同光強(qiáng)下微囊藻胞內(nèi)毒素含量的結(jié)果發(fā)現(xiàn), 除M.wesenbergii DC-M1不產(chǎn)毒外, 其余5株微囊藻在高光強(qiáng)下胞內(nèi)毒素含量即有顯著增加, 高濃度的微囊藻毒素為藻細(xì)胞的聚集提供了條件。在隨后的研究中發(fā)現(xiàn), 環(huán)境濃度的微囊藻毒素, 可通過(guò)激活部分與多糖合成相關(guān)的誘導(dǎo)因子而激發(fā)群體的聚集, 從而在微囊藻群體形態(tài)維持中起到重要作用[11]。這一結(jié)果也可以說(shuō)明, 在本研究中高光強(qiáng)促進(jìn)微囊藻胞內(nèi)毒素的增加也是微囊藻群體變大的因素之一。

綜上所述, 高光強(qiáng)能夠促進(jìn)微囊藻群體尺寸變大。但不同的微囊藻種, 其變化的生理學(xué)機(jī)制不同:光飽和點(diǎn)低的群體微囊藻, 通過(guò)分泌大量的EPS使群體尺寸變大以保護(hù)其自身免受高光強(qiáng)的傷害; 光飽和點(diǎn)高的群體微囊藻, 以加快生長(zhǎng)的方式, 增加群體尺寸以減小細(xì)胞密度上浮促進(jìn)光合吸收。同時(shí),微囊藻胞內(nèi)毒素的增加, 在微囊藻群體尺寸變大的過(guò)程中也起到重要作用。