方金紅

(安科余良卿藥業(yè)公司，安徽安慶 246001)

丹皮酚作為牡丹皮(Moutan Cortex)的主要有效成分，具有鎮(zhèn)靜、抗炎、抗過敏、抗氧化等作用，近年來受到越來越多的關(guān)注［1-3］。丹皮酚可以在植物體中萃取，但是受到資源限制，產(chǎn)量不高。利用化學(xué)原料人工合成丹皮酚，價(jià)廉易得，操作簡(jiǎn)單，適合工業(yè)化生產(chǎn)。丹皮酚的人工合成工藝大致包括將間苯二酚乙?；频?，4-二羥基苯乙酮，再經(jīng)甲基化制得2-羥基-4-甲氧基苯乙酮(丹皮酚)兩個(gè)步驟。而硫酸二甲酯(DMS)作為一種良好的甲基化試劑，被廣泛運(yùn)用于丹皮酚的化學(xué)合成［4-7］。但DMS劇毒，對(duì)局部黏膜有強(qiáng)烈的刺激和腐蝕作用，急性中毒后可能導(dǎo)致染色體突變，產(chǎn)生致畸致癌作用［8-10］。故應(yīng)有一種準(zhǔn)確而靈敏的分析方法來檢測(cè)化學(xué)合成丹皮酚中的硫酸二甲酯殘留以控制其限量。本方法運(yùn)用柱前衍生的方法，將硫酸二甲酯與對(duì)硝基苯酚在堿性及加熱的條件下發(fā)生反應(yīng)生成對(duì)硝基茴香醚，再通過紫外檢測(cè)器對(duì)其衍生產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 島津GC-2010型氣相色譜儀，島津LC-20AD型液相色譜儀，島津RID-10A示差折光檢測(cè)器，梅特勒-托利多AL-204型電子天平，毛細(xì)管柱(PEG-20M，30 m × 0.53 mm ×1 μm，蘭州中科凱迪化工新技術(shù)有限公司)，液相色譜柱(C18，250 mm ×4.6 mm × 5 μm，YMC)，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)(GC，Tedia，1101545)，二甲基亞砜(DMSO)(GC，阿拉丁，J1330031)，正己烷(HPLC，Tedia，12100708)，異丙醇(HPLC，Tedia，13020422)，甲醇(HPLC，Sigma-aldrich)，硫酸二甲酯(工業(yè)級(jí)，山東興輝化工，121214)，對(duì)硝基苯酚(AR，國(guó)藥集團(tuán)，20130222)，NaOH(AR，上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司，20121030)，丙酮(AR，上海中試化工總公司，20120103)，乙醚(AR，上海中試化工總公司，20111206)，對(duì)硝基茴香醚(AR，Aladdin Industrial Corporation，E1331040)，化學(xué)合成丹皮酚(合肥立方制藥股份有限公司，130510，130517，130522)。

圖1 硫酸二甲酯氣相色譜法檢測(cè)圖譜

1.2 氣相色譜法［11］程序升溫:50℃保持3 min，以30℃·min-1升溫至180℃，保持6 min;進(jìn)樣口溫度:200℃;FID 溫度:250℃;柱流速:6 mL·min-1;分流比:10∶1。分別用 DMF及 DMSO為溶劑，制成每毫升含硫酸二甲酯約50 μg的供試溶液，進(jìn)樣2 μL，記錄色譜圖，見圖1。

1.3 正相液相色譜法［12］流動(dòng)相:正己烷—異丙醇=70∶30;流速:1.0 mL·min-1;RID-10A 示差折光檢測(cè)器。以流動(dòng)相為溶劑，制成每毫升含硫酸二甲酯10 μg的供試溶液，進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖，見圖2。

圖2 硫酸二甲酯正相液相色譜—示差法檢測(cè)圖譜

1.4 柱前衍生—高效液相色譜法［13-14］

1.4.1 反應(yīng)原理 硫酸二甲酯在堿性和加熱的條件下與對(duì)硝基苯酚反應(yīng)生成對(duì)硝基茴香醚，經(jīng)C18柱分離，用紫外檢測(cè)器檢測(cè)(305 nm)。以保留時(shí)間定性，峰面積定量。反應(yīng)方程式如下:

1.4.2 實(shí)驗(yàn)操作 取10 mL丙酮加于100 mL量瓶中，精密稱定，加入數(shù)滴硫酸二甲酯，精密稱定，兩次稱量之差即為硫酸二甲酯的質(zhì)量。加丙酮稀釋至刻度，計(jì)算每毫升溶液中硫酸二甲酯的含量，臨用前配制。取2 mL硫酸二甲酯丙酮溶液，加0.4 g對(duì)硝基苯酚，8 mL 0.3%氫氧化鈉溶液，充分混勻。在40℃水浴中恒溫1 h，取出冷至室溫。用10 mL乙醚在分液漏斗中提取3 min，靜置分層。精密量取20 μL乙醚提取液作為對(duì)照溶液進(jìn)樣。取化學(xué)合成丹皮酚約3 g，精密稱定，加丙酮溶解，取2 mL，同法操作，制得乙醚提取液作為供試溶液，精密量取20 μL 進(jìn)樣。

1.4.3 色譜條件 檢測(cè)波長(zhǎng):305 nm;柱溫:55℃;流動(dòng)相:甲醇∶水 =25∶75;流速:1.0 mL·min-1;進(jìn)樣 20 μL，記錄色譜圖，見圖 3。

圖3 硫酸二甲酯柱前衍生—高效液相色譜法檢測(cè)

2 結(jié)果

2.1 反應(yīng)條件對(duì)衍生產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率的影響 試驗(yàn)考察了不同反應(yīng)時(shí)間、不同反應(yīng)溫度、不同氫氧化鈉的濃度條件下，硫酸二甲酯生成對(duì)硝基茴香醚的衍生反應(yīng)轉(zhuǎn)化率。在所考察的不同反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、加入氫氧化鈉濃度等反應(yīng)條件范圍內(nèi)，衍生反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率幾乎沒有變化，較為穩(wěn)定，結(jié)果見表1。

2.2 精密度

2.2.1 進(jìn)樣精密度 在柱前衍生—高效液相色譜法色譜條件下，取上述硫酸二甲酯反應(yīng)后的乙醚提取液，連續(xù)進(jìn)樣6針，各硫酸二甲酯衍生產(chǎn)物的峰面積RSD小于2.0%，說明儀器的進(jìn)樣精密度良好。

2.2.2 日內(nèi)精密度 按1.4.2項(xiàng)下對(duì)照溶液制備方法制備硫酸二甲酯溶液7份，1份作為對(duì)照，其余6份作為供試，反應(yīng)后分別測(cè)定供試中硫酸二甲酯衍生產(chǎn)物的含量，計(jì)算RSD=1.69%(n=6)，結(jié)果見表2。

表1 不同反應(yīng)條件衍生產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率

2.2.3 日間精密度 按日內(nèi)精密度試驗(yàn)方法，在不同的時(shí)間，由不同的人員，在不同的儀器上測(cè)定樣品溶液的峰面積并計(jì)算含量(標(biāo)示量%)，計(jì)算兩次試驗(yàn)的精密度，RSD=1.89%(n=12)，結(jié)果見表3。

2.3 定量限與檢測(cè)限 本方法測(cè)定硫酸二甲酯殘留的最低檢測(cè)限為0.82 ng，最低定量限為2.44 ng，定量限濃度樣品6次連續(xù)進(jìn)樣的結(jié)果保留時(shí)間的RSD值小于2%，峰面積的RSD值小于10%。

2.4 線性與范圍 在硫酸二甲酯為0.122～1.220 mg·L-1的濃度范圍內(nèi)，濃度C(mg·L-1)與峰面積A呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果見表4。

表2 日內(nèi)精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表3 日間精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=12)

表4 線性與范圍試驗(yàn)結(jié)果

2.5 加樣回收率 分別制備加入高、中、低硫酸二甲酯濃度的丹皮酚供試溶液各3份，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算硫酸二甲酯的測(cè)得量，測(cè)得硫酸二甲酯的平均回收率在80% ～120%范圍內(nèi)，平均回收率為98.8%，RSD=1.4%(n=9)，結(jié)果見表5。

表5 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.6 穩(wěn)定性 按硫酸二甲酯對(duì)照溶液的制備方法，制備硫酸二甲酯溶液，反應(yīng)后分別在不同的時(shí)間用兩臺(tái)液相色譜儀器(一臺(tái)進(jìn)樣器控溫為4℃，另一臺(tái)不控溫)檢測(cè)硫酸二甲酯衍生產(chǎn)物的峰面積，檢測(cè)結(jié)果如下:4℃時(shí)，在0、2、4、8、12、24 h 時(shí)，峰面積分別為 6 753、6 804、6 816、6 934、6 859、6 957，平均峰面積為6 854，RSD為1.15%(n=6);常溫時(shí)，在 0、1、2、3、4 h 時(shí)，峰面積分別為 6 526、6 633、7 016、7 409、7 537，平均峰面積為 7 024，RSD 為6.42%(n=5)。

2.7 樣品檢測(cè)結(jié)果 分別取3個(gè)批次化學(xué)合成丹皮酚樣品，按擬定的方法進(jìn)行測(cè)定，均未檢出硫酸二甲酯的殘留。

3 討論

硫酸二甲酯無紫外吸收，嘗試分別采用GC法、HPLC-RID法進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)表明，硫酸二甲酯遇高溫分解，用直接進(jìn)樣的GC法檢測(cè)時(shí)裂分成3～4個(gè)峰;HPLC-RID法的靈敏度過低，定量限高達(dá)約200 ng，無法滿足限度控制要求。

運(yùn)用柱前衍生化高效液相色譜法檢測(cè)化學(xué)合成丹皮酚中的硫酸二甲酯殘留，衍生反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率較高且穩(wěn)定，耐用性好，丹皮酚樣品不干擾對(duì)硫酸二甲酯的檢測(cè)，專屬性好，檢測(cè)限(0.82 ng)及定量限(2.44 ng)均滿足限度控制要求，靈敏度高，在0.122～1.220 mg·L-1的濃度范圍內(nèi)濃度與峰面積的線性關(guān)系良好，高、中、低三個(gè)濃度平均加樣回收率98.8%，準(zhǔn)確度高，方法日內(nèi)、日間精密度均良好。本法適用于化學(xué)合成丹皮酚中硫酸二甲酯殘留的檢測(cè)。運(yùn)用本法測(cè)定化學(xué)合成丹皮酚中硫酸二甲酯殘留時(shí)需注意，由于用于檢測(cè)的供試溶液為乙醚提取物，乙醚極易揮發(fā)，在常溫時(shí)應(yīng)立即檢測(cè)或?qū)⒐┰嚾芤旱蜏乇４妗?/p>

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