陳 冬，孫 宏，陳明衛(wèi)，王佑民

(1.安徽省壽縣縣醫(yī)院內(nèi)科，安徽壽縣 232200;2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，安徽合肥 230022)

2型糖尿病是慢性炎癥性疾?。?］，其病理生理特征主要是胰島素抵抗(insulin resistance，IR)，胰島素信號(hào)通路受損導(dǎo)致葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)轉(zhuǎn)位障礙，目前對(duì)GLUT4的研究成為糖尿病發(fā)病機(jī)制研究中熱點(diǎn)之一。近年研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌作為一種非傳統(tǒng)意義上的內(nèi)分泌器官，在體內(nèi)也可表達(dá)并分泌一定量的脂聯(lián)素，體外研究發(fā)現(xiàn)分化的L6肌細(xì)胞也具有類似的生理效應(yīng)［2］。研究證實(shí)，作為脂肪因子之一的脂聯(lián)素，和胰島素抵抗之間有密切的關(guān)系［3］，但骨骼肌源性脂聯(lián)素的調(diào)控機(jī)制以及在骨骼肌IR發(fā)生發(fā)展中的地位和作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過建立棕櫚酸誘導(dǎo)的大鼠L6細(xì)胞IR模型，并應(yīng)用噻唑烷二酮類藥物(TZDs)吡格列酮干預(yù)，來探討骨骼肌源性脂聯(lián)素對(duì)骨骼肌IR模型GLUT4表達(dá)的影響，以及PPAR-γ激動(dòng)劑吡格列酮其改善胰島素敏感性的機(jī)制是否涉及激活脂聯(lián)素。通過本研究，可增加對(duì)骨骼肌IR機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為臨床治療提供一定基礎(chǔ)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與試劑 大鼠L6肌細(xì)胞;其他包括高糖DMEM培養(yǎng)基和無酚紅DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清(FBS)PA及MTT;相關(guān)抗體包括兔抗鼠全長脂聯(lián)素抗體、GLUT4抗體;兔β-actin抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體和山羊抗鼠抗體;以及化學(xué)發(fā)光底物試劑盒。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化 大鼠L6細(xì)胞復(fù)蘇后接種在培養(yǎng)瓶中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。后改用含2%胎牛血清的無酚紅DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化，至細(xì)胞生長出肌管，通過考馬斯藍(lán)染色，鑒定肌管形成后，認(rèn)為大鼠L6細(xì)胞誘導(dǎo)分化成熟。

1.2.2 胰島素抵抗細(xì)胞模型的建立 (1)實(shí)驗(yàn)分組:將細(xì)胞以每孔1×105個(gè)的密度接種于96孔培養(yǎng)板，誘導(dǎo)分化為成熟的骨骼肌細(xì)胞后，實(shí)驗(yàn)分為①對(duì)照組(NC組)，即大鼠L6細(xì)胞組;②PA誘導(dǎo)組(IR 組)分別用不同濃度的 PA(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1)進(jìn)行干預(yù)，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，分別收集培養(yǎng) 2、4、8、12、24、36 h 后的細(xì)胞上清液，建立胰島素抵抗組;③胰島素抵抗模型+吡格列酮組，在建立成功IR組基礎(chǔ)上，加用吡格列酮，建立IR+PIO組。(2)MTT法檢測棕櫚酸對(duì)L6細(xì)胞活性的影響:L6成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟骨骼肌細(xì)胞后，上述PA誘導(dǎo)組中分別加入10-7mol·L-1的胰島素。每孔加入MTT 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4～5 h后，各孔加入DMSO 150 μL，搖床振蕩，酶標(biāo)儀測定492 nm下各組細(xì)胞的吸光度，檢測棕櫚酸對(duì)各組細(xì)胞活性的影響。(3)葡萄糖消耗試驗(yàn):用葡萄糖氧化酶—過氧化物酶法測定上述各管上清液中所剩葡萄糖的濃度，同時(shí)建立標(biāo)準(zhǔn)管，在490 nm處測定各管吸光度。通過測定管與標(biāo)準(zhǔn)管吸光度的比值，確定上清液殘存的葡萄糖濃度，并最終確定胰島素抵抗模型的建立。(4)Western blot分別檢測NC組、IR組和IR+PIO組APN和GLUT4的蛋白表達(dá):用APN和GLUT4灰度值與β-actin灰度值的比值作為APN和GLUT4的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。觀測資料主要為計(jì)量數(shù)據(jù)，以(±s)表示，均通過正態(tài)性檢驗(yàn)。多組間多時(shí)點(diǎn)間綜合分析為兩因素重復(fù)測量方差分析;各組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度、不同時(shí)間的PA對(duì)L6細(xì)胞活性的影響 MTT結(jié)果顯示濃度為0.2～0.6 mmol·L-1的PA作用于L6細(xì)胞2～36 h后對(duì)細(xì)胞的活性無影響。而0.8～1.0 mmol·L-1的PA分別作用24、36 h時(shí)對(duì)細(xì)胞的活性有影響，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表 1。

表1 不同濃度、不同時(shí)間的PA對(duì)大鼠L6細(xì)胞活性的影響(±s)

表1 不同濃度、不同時(shí)間的PA對(duì)大鼠L6細(xì)胞活性的影響(±s)

注:與NC組比較，*P＜0.05。

作用時(shí)間/h組別 劑量/mmol·L-1 49±0.021 0.541±0.015 0.483±0.021 PA誘導(dǎo)組(IR組) 0.2 0.523±0.014 0.518±0.020 0.529±0.017 0.541±0.019 0.540±0.019 0.481±0.018 0.4 0.509±0.020 0.522±0.024 0.532±0.019 0.538±0.017 0.540±0.018 0.478±0.017 0.6 0.521±0.017 0.517±0.018 0.540±0.018 0.541±0.019 0.531±0.017 0.484±0.019 0.8 0.513±0.016 0.528±0.018 0.538±0.018 0.536±0.017 0.497±0.017*0.436±0.018*1.0 0.511±0.017 0.520±0.017 0.535±0.015 0.539±0.018 0.524±0.026*0.465±0.028 12 24 36 NC組 0.0 0.517±0.020 0.521±0.016 0.537±0.018 0.5 2 4 8*

2.2 不同濃度、不同時(shí)間的PA對(duì)L6細(xì)胞葡萄糖代謝的影響 (1)作用2 h后，各組上清液中剩余葡萄糖濃度與NC組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);(2)作用4 h后，1.0 mmol·L-1PA作用下的細(xì)胞上清液葡萄糖濃度明顯高于NC組(P＜0.05)，其余濃度的PA組和NC組相比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05);(3)作用 8、12 h 后，0.6、0.8、1.0 mmol·L-1PA作用下的細(xì)胞上清液葡萄糖濃度明顯高于 NC 組(P ＜0.05)，0.2、0.4 mmol·L-1濃度的PA組與NC組相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05);(4)作用 24 h 以后，0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1PA作用下的細(xì)胞上清液葡萄糖濃度較NC組顯著升高(P＜0.05)，而0.2 mmol·L-1濃度的PA組與NC組相比較，差異始終無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

2.3 三組脂聯(lián)素及GLT4的Western blot表達(dá)水平印跡圖 見圖1。兩兩比較顯示:(1)與NC組比較，IR組APN、GULT4蛋白表達(dá)水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見圖2);(3)與IR組比較，IR+PIO組APN、GULT4蛋白表達(dá)水平均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見圖3)。

圖1 三組APN及GLUT4蛋白表達(dá)水平印跡圖

圖2 NC組和IR組APN和GLUT4蛋白水平表達(dá)比較

圖3 IR組和IR+PIO組APN和GLUT4蛋白水平表達(dá)比較

3 討論

為研究骨骼肌IR發(fā)生機(jī)制，建立相關(guān)的胰島素抵抗模型尤為重要。因?yàn)橐葝u素刺激下的骨骼肌細(xì)胞的葡萄糖代謝能力是判斷骨骼肌胰島素敏感性的主要指標(biāo)，故本研究應(yīng)用葡萄糖氧化酶—過氧化物酶法(GOD-POD法)檢測在不同濃度、不同時(shí)間的棕櫚酸作用下的L6細(xì)胞培養(yǎng)液中殘存葡萄糖含量，來評(píng)價(jià)L6細(xì)胞在胰島素刺激下的葡萄糖攝取和利用能力，即胰島素敏感性，從而判斷是否存在IR，以及IR模型建立成功與否［4］。研究發(fā)現(xiàn)，通過對(duì)不同時(shí)間、不同濃度PA作用后的L6細(xì)胞上清液殘存葡萄糖濃度測定，顯示PA對(duì)胰島素刺激下的骨骼肌細(xì)胞的葡萄糖代謝能力有抑制作用。在本研究中，當(dāng)較高濃度的PA作用于L6細(xì)胞達(dá)24 h后，MTT方法測定的細(xì)胞活性明顯降低，提示高濃度棕櫚酸長時(shí)間刺激可對(duì)L6細(xì)胞的活性產(chǎn)生抑制作用。由于上清液中葡萄糖濃度的增加，可間接反映胰島素刺激下的L6細(xì)胞的葡萄糖代謝能力的降低，即L6細(xì)胞胰島素敏感性的降低，由此可以認(rèn)為本研究中PA誘導(dǎo)的大鼠L6細(xì)胞IR模型建立成功。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這種模型的建立與PA的作用濃度密切相關(guān)，PA濃度為0.4 mmol·L-1至少24 h后才能建立，而當(dāng)PA濃度提高至1.0 mmol·L-1時(shí)，4 h后即可建立，與國內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［5］。

自1995年Scherer和Lodish首次發(fā)現(xiàn)了脂聯(lián)素的存在，目前相關(guān)研究證明，脂聯(lián)素除在脂肪組織大量表達(dá)外，在一些非脂肪組織細(xì)胞中也有表達(dá)。而對(duì)脂肪組織以外脂聯(lián)素的研究相對(duì)較少，其作用機(jī)制尚不明確。Krause等［6］證實(shí)在大鼠骨骼肌組織以及L6肌細(xì)胞中存在脂聯(lián)素的表達(dá)，表達(dá)的分布不僅在肌細(xì)胞肌膜中，而且在肌細(xì)胞的IIA以及IID型肌纖維中也存在。通過對(duì)脂聯(lián)素基因敲除大鼠的進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)骨骼肌分泌的脂聯(lián)素在維持骨骼肌收縮功能以及表型等方面發(fā)揮重要作用，初步證明骨骼肌可以通過自分泌的方式分泌脂聯(lián)素，并在保持骨骼肌細(xì)胞功能、脂肪酸β氧化以及葡萄糖攝取等方面發(fā)揮重要的作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，無論在NC組還是IR組，應(yīng)用Western blot方法，均發(fā)現(xiàn)L6肌細(xì)胞表達(dá)脂聯(lián)素，和國外報(bào)道相一致［6］。

與對(duì)照組相比，IR組中的L6肌細(xì)胞脂聯(lián)素表達(dá)水平明顯下降，表明L6肌細(xì)胞脂聯(lián)素表達(dá)與骨骼肌IR之間存在內(nèi)在聯(lián)系。有關(guān)IR狀態(tài)下骨骼肌源性脂聯(lián)素下調(diào)表達(dá)的原因，目前尚不清楚。Coll等［7］研究發(fā)現(xiàn)棕櫚酸誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與了骨骼肌的胰島素抵抗。相關(guān)炎癥因子表達(dá)增加，抑制骨骼肌細(xì)胞內(nèi)過氧化物酶體增值物激活受體(PPAR)的表達(dá)。骨骼肌細(xì)胞中脂聯(lián)素的表達(dá)是依賴于PPAR的方式。其中PPAR-γ在葡萄糖代謝中起重要作用。PPAR-γ增加胰島素敏感性的機(jī)制，一個(gè)重要的方面就是通過脂聯(lián)素等信號(hào)通路來參與葡萄糖穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。Lopez等［8］研究表明TZD可直接作用于大鼠骨骼肌L6細(xì)胞內(nèi)PPAR-γ。同時(shí)，Hajri等［9］發(fā)現(xiàn)在3T3-L1和人體脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)中，胰島素可明顯增加脂聯(lián)素的表達(dá)和分泌，而TNF-α和IL-6則可強(qiáng)烈抑制這種效應(yīng)。正是多因素的共同作用，導(dǎo)致在骨骼肌IR模型中，脂聯(lián)素的表達(dá)明顯減少。而在骨骼肌IR模型中，加入PPAR-γ激動(dòng)劑吡格列酮后，脂聯(lián)素表達(dá)水平較前顯著增加，與NC組無顯著差異，表明骨骼肌源性脂聯(lián)素的表達(dá)是依賴于PPAR-γ的方式。TZD直接作用于大鼠骨骼肌L6細(xì)胞內(nèi)PPAR-γ，從而刺激脂聯(lián)素的分泌。

關(guān)于脂聯(lián)素增加GLUT4的分泌，目前普遍認(rèn)為，在骨骼肌中，脂聯(lián)素首先與脂聯(lián)素受體1在細(xì)胞膜外結(jié)合后，刺激脂聯(lián)素受體結(jié)合蛋白1(APPL1)的結(jié)合，再激活下游信號(hào)傳導(dǎo)通路，最終完成增加骨骼肌細(xì)胞脂肪酸氧化、GLUT4的表達(dá)和膜轉(zhuǎn)位，改善骨骼肌IR等生物學(xué)效應(yīng)。GLUT4是主要的葡萄糖運(yùn)載體，其所介導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)是骨骼肌糖代謝的主要限速步驟。GLUT4的這種活性狀態(tài)的改變與骨骼肌IR密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)［10］脂聯(lián)素在骨骼肌與其受體結(jié)合后，可激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的活性，活化的AMPK可抑制S6激酶(S6K)，進(jìn)而減弱對(duì)胰島素受體底物1(IRS-1)的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，證明脂聯(lián)素信號(hào)通路可能與胰島素信號(hào)通路相互交叉，相互聯(lián)系。因此，脂聯(lián)素提高骨骼肌胰島素敏感性的生物學(xué)機(jī)制之一可能是通過活化AMPK途徑實(shí)現(xiàn)，并激活其下游p38MAPK信號(hào)通路，增加GLUT4的表達(dá)［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，和對(duì)照組比較，在骨骼肌IR模型組中，應(yīng)用Western blot方法測定的L6細(xì)胞源性脂聯(lián)素表達(dá)水平下降，同時(shí)L6細(xì)胞中GLUT4的表達(dá)下降。而在加入PPAR-γ激動(dòng)劑吡格列酮后，脂聯(lián)素表達(dá)增加，GLUT4表達(dá)也同步增加。這種同向改變的趨勢，表明L6細(xì)胞源性脂聯(lián)素表達(dá)和其GLUT4表達(dá)是密切相關(guān)的，骨骼肌源性脂聯(lián)素增加骨骼肌中GLUT4活性，從而可能對(duì)骨骼肌IR狀態(tài)發(fā)揮改善作用。

總之，通過本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠L6細(xì)胞株通過培養(yǎng)并分化成熟后，經(jīng)過棕櫚酸的誘導(dǎo)，可以較容易建立大鼠L6細(xì)胞胰島素抵抗模型;大鼠L6細(xì)胞可以分泌和表達(dá)脂聯(lián)素，骨骼肌源性脂聯(lián)素上調(diào)L6細(xì)胞GLUT4的表達(dá);吡格列酮作為 PPAR-γ激動(dòng)劑，可增加大鼠L6細(xì)胞脂聯(lián)素的分泌，進(jìn)而改善胰島素敏感性。

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