湛 曉 牛立志 曾健瀅 梁 冰 周 亮 方 剛 李書英 鄧春娟 鄧春梅

姚 飛 汪 媛 金 利 張 波 楊惠霏 周序瓏 李家亮 劉建國 徐克成

中國是原發(fā)性肝癌高發(fā)的國家，肝癌病死率占 惡性腫瘤的第二位[1]。原發(fā)性肝癌手術(shù)切除是目前肝癌患者獲得長期生存乃至根治的主要方法之一，但能獲得手術(shù)切除的肝癌患者不足20%。對于不可切除的原發(fā)性肝癌，化療成為最主要的治療手段，但由于其可能的副作用，其療效仍然有限。近年來，微創(chuàng)外科與腫瘤局部治療的興起為肝癌的治療開辟了新的方向。如射頻消融[2]，微波消融[3]與冷凍消融[4]都分別成為不能手術(shù)切除肝癌患者的選擇之一。其中氬氦刀冷凍技術(shù)因其具有創(chuàng)傷小、安全性高等特點已在晚期肝癌治療中較多應(yīng)用[5-6]。有報道稱肝癌冷凍治療的不良反應(yīng)總發(fā)生率為15%～20%[7-8]，一般為寒戰(zhàn)、發(fā)熱、肝區(qū)疼痛與血清酶升高等[9]，但對膽囊周邊肝腫瘤進行冷凍是否引起膽囊漏尚未明確。有鑒于此，本次研究在白兔肝臟靠近膽囊0.5 cm處進行氬氦刀消融，觀察術(shù)后7 d肝臟消融區(qū)與膽囊的形態(tài)改變及病理學(xué)改變，以研究冷凍膽囊側(cè)肝腫瘤的安全性及有效性。

材料與方法

一、材料

1.實驗動物

普通級新西蘭兔3只，雌性，體重范圍2.5～3.0 kg，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號[SCXK（粵）2011-0015]，動物合格證號 [粵監(jiān)證字44002100000654]。

2.主要實驗器械與試劑

CryocareTM氬氦刀系統(tǒng) （美國Endocare公司），包括主機與寬1.4 mm的冷凍探針；監(jiān)護儀（荷蘭Philips公司，型號M8001A），鹽酸氯胺酮注射液購自福建古田藥業(yè)有限公司 （批號為H35020148）。硫酸阿托品注射液購自徐州萊恩藥業(yè) （批號為1211112）。

二、方法

1.術(shù)前準(zhǔn)備及麻醉

動物禁食24 h，禁水12 h。術(shù)前在實驗兔腿部肌肉注射阿托品（0.02 mg/kg）及鹽酸氯胺酮注射液（44 mg/kg）誘導(dǎo)麻醉后，家兔仰臥位固定，在劍突后緣至恥骨前緣備皮，術(shù)中在后腿肌肉注射氯胺酮注射液（44 mg/kg）以維持麻醉。

2.氬氦刀消融步驟

麻醉后開腹，暴露肝左上葉，直視下將冷凍探針插入肝臟0.5 cm，使與膽囊壁距離為0.5 cm，設(shè)置100%氬氣，啟動系統(tǒng)，先冷凍2 min，再復(fù)溫2 min，重復(fù)一次冷凍-復(fù)溫循環(huán)，術(shù)程共8 min，消融結(jié)束后拔出探針即完成氬氦刀消融術(shù)。于消融區(qū)兩端各置一縫線作為標(biāo)記后結(jié)束手術(shù)，將臟器回納腹腔，常規(guī)閉腹，待實驗兔蘇醒后自由飲食，護理期間不給予藥物。

3.術(shù)中與術(shù)后觀察

術(shù)中觀察冷凍消融時肝臟及膽囊表面形態(tài)變化，用游標(biāo)卡尺測量并記錄組織表面消融區(qū)域最大半徑。術(shù)后第7天對實驗兔實行安樂死，觀察肝臟與膽囊冷凍消融區(qū)域及周邊臟器形態(tài)變化。

4.病理檢查

取組織標(biāo)本于福爾馬林中固定24 h以上，石蠟包埋，梯度酒精脫水，二甲苯透明，連續(xù)切片，厚度5 μm，常規(guī)蘇木精-伊紅染色，封片后鏡下觀察。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)以Graphpad Prism 5（GraphPad,USA）軟件進行分析。結(jié)果表示為±s，采用t檢驗。P<0.05表示差異顯著。

結(jié) 果

一、術(shù)中與術(shù)后消融區(qū)形態(tài)觀察

1.術(shù)中肝臟及膽囊形態(tài)變化

冷凍消融結(jié)束后可見肝臟與同一側(cè)膽囊形成一白色橢圓形冰球，觸感堅硬，邊緣清晰。周圍組織形態(tài)及顏色無異常（圖1a）。

2.術(shù)后消融區(qū)域及周邊臟器形態(tài)變化

消融7 d后肝臟膈面原消融區(qū)可見一個類圓形黃色壞死灶，表面最大徑為（2.55±0.78）cm，外周有一圈淡粉紅色的分隔帶，與周圍組織分界明顯（圖1b）；肝臟臟面形成一個類圓形黃色壞死灶（圖1c）；表面最大徑為（2.25±0.35）cm。

1/3實驗兔出現(xiàn)膽囊穿孔，直徑為1.5 cm （圖1d）。 粘連情況：實驗兔腹壁（2/3）、膈?。?/3）、腸系膜（1/3）和結(jié)腸（1/3）與肝臟膈面消融區(qū)發(fā)生小片段淺度粘連。胃壁（1/3）與膽囊臟面消融灶區(qū)表面發(fā)生嚴(yán)重粘連。

二、病理組織學(xué)觀察

1.肝臟消融區(qū)7 d后組織學(xué)觀察

廣泛肝組織壞死。肝組織結(jié)構(gòu)不完整，肝小葉輪廓隱約可見，肝索和肝板崩解斷裂呈空網(wǎng)狀，肝竇局部充血、局部有大量退變炎性細(xì)胞浸潤和少量崩解紅細(xì)胞。核溶解（圖2）。

2.術(shù)后7 d膽囊組織學(xué)觀察

1/3實驗兔膽囊壁全層壞死，肌層崩解，黏膜消失，壞死區(qū)見大量均一紅染物質(zhì)（圖3）。

三、實驗室結(jié)果觀察

血清AST及ALT水平均在術(shù)后顯著升高。其中AST呈一過性升高，在術(shù)后第7d恢復(fù)至正常水平（表 1）。

圖1 兔肝氬氦刀消融術(shù)觀察（a.距膽囊邊緣0.5 cm插入氬氦刀探針，冷凍術(shù)中膽囊周邊肝臟消融區(qū)出現(xiàn)橢圓形白色冰球；b.消融7 d后肝臟膈面壞死灶；c.消融7 d后肝臟臟面壞死灶；d.膽囊穿孔）

圖2 兔肝冷凍消融7天后組織學(xué)觀察[a.炎細(xì)胞反應(yīng)帶：壞死區(qū)內(nèi)可見大量中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤；b.肝組織壞死區(qū)：可見凝固性壞死肝組織；c.出血充血區(qū)：壞死區(qū)內(nèi)可見少量紅細(xì)胞；d.肉芽組織：可見較多成纖維細(xì)胞增生；e.肝臟組織：肝細(xì)胞索排列較整齊，肝竇內(nèi)可見較多淋巴細(xì)胞浸潤（HE染色，400×）]

圖3 肝冷凍術(shù)后7 d膽囊壞死 （HE染色，40×）

表1 兔冷凍膽囊側(cè)肝臟術(shù)前后血清轉(zhuǎn)氨酶水平變化 （x± s，U/L）

討 論

目前，臨床上用于實體腫瘤消融的氬氦刀冷凍系統(tǒng)，主要為美國Endocare公司1998年生產(chǎn)的CryocareTM和以色列Galil medical公司2000年生產(chǎn)的Cryo-HitTM氬氦冷凍系統(tǒng)。上述兩種氬氦刀冷凍系統(tǒng)原理基本相同，都是利用高壓氬氣在超導(dǎo)刀尖端快速膨脹時要吸收周圍的熱量 （焦耳－湯姆遜原理），使周圍組織溫度迅速下降，通過溫度降低與復(fù)溫，產(chǎn)生直接細(xì)胞損傷與間接細(xì)胞損傷，引發(fā)腫瘤細(xì)胞死亡。同時，由于流動血流的溫?zé)嵝?yīng)，該技術(shù)也可運用于鄰近下腔靜脈、門靜脈等大血管的腫瘤，優(yōu)勢顯著。然而，該技術(shù)也存在不可忽視的不良反應(yīng)。如拔針后疼痛出血、肝實質(zhì)破裂、胸腔滲液、血小板降低、腹腔出血，肝衰竭和急性腎衰竭以及冷休克[9-10]。有文獻(xiàn)報道稱膽漏發(fā)生率為5%～10%，但由于肝臟組織因其血供較為豐富，局部微環(huán)境差異較大，而且不同的消融程序?qū)τ谙谛Ч绊懖煌枰A(chǔ)實驗數(shù)據(jù)予以支持。

在本次實驗中，我們用1.4 mm的冷凍探針，啟用100%的氬氣對靠近膽囊0.5 cm的肝組織進行冷凍2 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膽囊發(fā)生穿孔（1/3）。光鏡示膽囊壁全層壞死，肌層崩解，黏膜消失，這可能是由于膽管、膽囊沒有“熱池”效應(yīng)，以致冷凍過程中被凍傷、凍死。因此，對鄰近膽管和膽囊的腫瘤進行冷凍治療，尤其在合并遠(yuǎn)端膽管梗阻者，應(yīng)特別注意預(yù)防膽管、膽囊的損傷，以防嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生。本研究中，病理結(jié)果顯示消融中心區(qū)廣泛肝組織壞死。肝組織結(jié)構(gòu)不完整，肝小葉輪廓隱約可見，肝索和肝板崩解斷裂呈空網(wǎng)狀，肝竇局部充血、局部有大量退變炎性細(xì)胞浸潤和少量崩解紅細(xì)胞。核溶解。且消融區(qū)與周邊組織分界清晰，表明本次冷凍有效消融膽囊周邊肝組織，另外，術(shù)后血清AST與ALT的急劇升高也提示了肝細(xì)胞冷凍壞死后，細(xì)胞內(nèi)酶釋放。該結(jié)果與現(xiàn)有的研究結(jié)果具有一致性。

總之，本次研究結(jié)果顯示，消融部位肝臟組織完全壞死，消融灶和周圍組織分界明顯，但可能發(fā)生膽囊漏。因此，對于靠近膽囊的肝臟腫瘤來說，需要做好術(shù)前評估，謹(jǐn)慎利用氬氦刀進行治療，減少膽漏等嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生。同時，還需要對該技術(shù)進一步研究，從而明確氬氦刀治療肝癌的適應(yīng)范圍與臨床應(yīng)用價值。

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