張玉果,馮海光

(1.邯鄲市神康藥業(yè)有限公司,河北邯鄲056011；2.河南省鶴壁市山城區(qū)畜牧局，河南鶴壁458000）

雞大腸桿菌病是由埃希氏大腸桿菌(E.coli)的某些致病性菌株所引起的多種疾病的總稱，也是對養(yǎng)雞業(yè)危害嚴(yán)重及常見的一種細(xì)菌性疾病，臨床癥狀和病理變化多變,且多與病毒性疾病和其他細(xì)菌性疾病并發(fā),給養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。隨著我國畜牧業(yè)的發(fā)展,盲目大量濫用抗生素現(xiàn)象普遍發(fā)生。有的養(yǎng)雞場從購入雛雞開始就不斷喂服抗菌藥物,直至出欄上市為止,還有的養(yǎng)雞場在飼料中不合理地混合添加抗菌藥物,免疫注射時(shí)也給予大量的抗菌藥物,導(dǎo)致大腸桿菌的耐藥菌株不斷出現(xiàn),耐藥譜不斷擴(kuò)大,一旦發(fā)病,很多藥物都難以奏效;同時(shí)也加劇了抗菌藥物在畜禽體內(nèi)的殘留,給我國畜牧業(yè)的持續(xù)發(fā)展和人類的身體健康帶來潛在危害。這就需要對雞源大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，以便準(zhǔn)確有效地篩選出高敏藥物進(jìn)行治療。

近年來，埃希氏大腸桿菌的耐藥性呈上升趨勢。20世紀(jì)50年代禽致病性埃希氏大腸桿菌幾乎沒有耐藥性產(chǎn)生，而60年代的分離株對鏈霉素、四環(huán)素產(chǎn)生了耐藥性，20世紀(jì)70年代對氨芐西林、氯霉素、磺胺甲基異惡唑等產(chǎn)生了耐藥性，80年代至90年代初對阿莫西林、慶大霉素、卡那霉素、萘啶酸、頭孢塞吩等產(chǎn)生了耐藥性。隨著時(shí)間的推移,埃希氏大腸桿菌的耐藥率大幅度上升,多重耐藥菌株劇增,耐藥譜增寬,臨床上分離的埃希氏大腸桿菌對環(huán)丙沙星的耐藥性已居耐藥性的首位。據(jù)報(bào)道，微生物對大多數(shù)喹諾酮類藥物的耐藥率達(dá)10%以上，而在歐美等發(fā)達(dá)國家,埃希氏大腸桿菌對喹諾酮類藥物均很敏感,耐藥率一般只有5%左右；在我國部分地區(qū)埃希氏大腸桿菌對大多數(shù)喹諾酮類藥物的耐藥率卻高達(dá)40%以上。產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)的埃希氏大腸桿菌現(xiàn)已分布全球各個(gè)角落,它們的流行呈增長趨勢,也導(dǎo)致埃希氏大腸桿菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性遍及全世界。

大腸桿菌抗原性復(fù)雜、血清型多樣，特別是在規(guī)?；B(yǎng)雞業(yè)的迅速發(fā)展下，雞源大腸桿菌新的血清型又在不斷出現(xiàn)，且其不同的菌株對同一種抗菌藥物的敏感性也不相同，使得抗菌藥物的防治效果越來越差，獸醫(yī)工作者不能很好地掌握藥物對其的敏感程度。因此，對雞源大腸桿菌的耐藥性進(jìn)行監(jiān)測與分析,對于指導(dǎo)臨床合理用藥及控制本病的流行非常重要。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 培養(yǎng)基：普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠生產(chǎn)。

1.1.2 藥敏試紙片：由鶴壁市山城區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供。

1.1.3 菌株：由鶴壁市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供（20株）。

1.1.4 器材：恒溫培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、接種環(huán)、酒精燈、顯微鏡、移液器、滴頭、鑷子、標(biāo)簽、記號筆、直尺。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備

稱取普通營養(yǎng)瓊脂45克、麥康凱瓊脂23克，分別置于兩個(gè)潔凈三角燒瓶中,然后各加入滅菌蒸餾水1000毫升、500毫升，加熱煮沸溶解后放入高壓蒸汽鍋內(nèi)121℃滅菌20分鐘；當(dāng)瓊脂溫度降到55℃時(shí)，在超凈工作臺(tái)上分別均勻地倒入滅菌的平皿內(nèi),每個(gè)滅菌的平皿倒入15毫升，待凝固后置37℃恒溫箱中培養(yǎng)18小時(shí)；放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株的培養(yǎng)

用接種環(huán)釣取少許菌株，常規(guī)劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,進(jìn)行純培養(yǎng)。而后釣取純培養(yǎng)的菌落接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)24小時(shí),見生長出磚紅色菌落;再挑取純培養(yǎng)的菌落涂片、革蘭氏染色、鏡檢，呈單個(gè)散在或成對的革蘭氏陰性紅色小桿菌。根據(jù)上述細(xì)菌培養(yǎng)特性和染色鏡檢，可初步驗(yàn)證為大腸桿菌,純培養(yǎng)菌落備用。

1.2.3 試驗(yàn)操作方法——藥敏片法

藥敏試驗(yàn)：按WHO推薦的藥敏片法進(jìn)行。本法是根據(jù)抑菌環(huán)直徑大小來判定細(xì)菌對抗菌藥物的高敏、中敏、耐藥的方法。該方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單、易于掌握;缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)，只能進(jìn)行半定量測定。

用接種環(huán)釣取l環(huán)純培養(yǎng)的大腸桿菌，置于1毫升滅菌生理鹽水中，充分混勻后用滅菌吸管吸取此液，均勻的布滿于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的整個(gè)表面；待營養(yǎng)瓊脂表面稍作干燥后，用滅菌鑷子取各種藥敏紙片均勻貼到營養(yǎng)瓊脂表面,(為保證藥敏紙片與營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面完全接觸，各個(gè)藥敏紙片都應(yīng)用滅菌鑷子輕壓一下）每個(gè)平板放6張藥敏試紙片，37℃培養(yǎng)24小時(shí)；觀察結(jié)果，用直尺測定抑菌圈的直徑。整個(gè)操作過程都應(yīng)注意無菌操作，避免雜菌污染。

1.2.4 判定標(biāo)準(zhǔn)

按抑菌圈的直徑大小作為敏感性高低的判斷標(biāo)準(zhǔn)。抑菌圈大表明細(xì)菌對該藥物的敏感性高，耐藥性低；反之，則表明細(xì)菌對該藥物的敏感性低，耐藥性高。藥敏紙片的種類及判定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 藥敏紙片的種類及判定標(biāo)準(zhǔn)

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 20株雞源大腸桿菌菌株來源情況見表2

表2 20株雞源大腸桿菌菌株的來源情況

2.2 20株雞源大腸桿菌對12種藥物的耐藥情況見表3

由表3可以看出，20株雞源大腸桿菌對12種抗菌藥物都有不同程度的耐藥性。青霉素、四環(huán)素對其完全沒有作用，全部耐藥；紅霉素、利福平對其作用也很小，沒有對其產(chǎn)生高敏；而阿米卡星、頭孢曲松和頭孢唑啉的敏感性較高。具體統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表4。

表3 20株雞源大腸桿菌對12種藥物耐藥情況

由表4可以看出：對雞源大腸桿菌產(chǎn)生嚴(yán)重耐藥性的藥物依次是青霉素、四環(huán)素、林可霉素、環(huán)丙沙星、紅霉素、蒽諾沙星，這6種藥物的耐藥率都大于50%，耐藥最為嚴(yán)重的是青霉素，達(dá)到了100%；對大腸桿菌中度敏感的藥物依次是：頭孢唑啉、諾氟沙星、卡那霉素，中敏率分別是60%、55%、50%；高敏的藥物分別是：氟苯尼考、頭孢曲松、阿米卡星，高敏率分別是70%、65%、60%。

2.3 不同地區(qū)分離菌株耐藥性比較見表5

由表5中可以看出，不同地區(qū)雞源大腸桿菌的耐藥情況不同，敏感藥物也不一樣，因此應(yīng)根據(jù)各地的實(shí)際情況合理用藥。

3 討論

從試驗(yàn)結(jié)果看，大多數(shù)雞場的大腸桿菌存在著廣泛的耐藥性，這給藥物治療帶來了很大的難度，造成這種局面與下列因素有關(guān)：養(yǎng)殖戶用藥過程中選藥、劑量、療程不當(dāng)；存在嚴(yán)重濫用藥物現(xiàn)象，常常在未確定病因的情況下，大量使用各種各樣的抗菌藥；目前獸藥市場相當(dāng)混亂，同一有效成分命名五花八門，誤導(dǎo)了專業(yè)戶；假冒偽劣獸藥產(chǎn)品充斥市場，個(gè)別獸藥廠家產(chǎn)品的有效成分含量不足，標(biāo)記的劑量、療程常不能達(dá)到治療效果。

3.1 大腸桿菌耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制

表4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

表5 不同地區(qū)分離菌株耐藥性比較

3.1.1 一是先天性獲得，主要是由于其細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定，先天性獲得耐藥性的變化一般不大。

3.1.2 二是后天性獲得，主要是由于耐藥性質(zhì)粒的產(chǎn)生，如：R質(zhì)粒。R質(zhì)粒的主要特征：一是能通過細(xì)菌與細(xì)菌間的接觸，由耐藥菌株轉(zhuǎn)移到敏感菌株，從而使原來的敏感菌株獲得耐藥性；另一特征是有自我復(fù)制的功能，在細(xì)胞分裂時(shí)，R質(zhì)粒也同時(shí)進(jìn)行復(fù)制從而使子細(xì)胞也帶有耐藥質(zhì)粒。R質(zhì)粒的耐藥機(jī)制有：質(zhì)?；蚓幋a產(chǎn)生各種鈍化酶分解抗生素；耐藥性質(zhì)?？刂埔恍┘?xì)菌的細(xì)胞膜通透性，使抗菌藥物不能進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)，從而使細(xì)菌具有耐藥性；耐藥質(zhì)粒的基因編碼產(chǎn)生一些特殊的酶，阻止抗生素與細(xì)胞內(nèi)靶子結(jié)合而產(chǎn)生抗藥性。R質(zhì)粒的傳播是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的重要原因之一，特別是在規(guī)?；B(yǎng)殖條件下，R質(zhì)粒更易在細(xì)菌之間傳播，造成耐藥菌株的廣泛產(chǎn)生。

3.2 解決其耐藥性的對策

3.2.1 合理用藥、謹(jǐn)慎用藥和正確使用抗菌藥物

在臨床選用抗菌藥物治療雞大腸桿菌病時(shí)，要考慮本場的用藥習(xí)慣，選擇少用或未曾用過的藥物，避免單一和長期重復(fù)使用同一種抗菌藥物。一旦選定了正確的抗生素，下一步就要確定準(zhǔn)確的藥物劑量、頻率和療程。最好在分離病原菌的基礎(chǔ)上先做藥敏試驗(yàn)，選用高敏藥物，這樣才能達(dá)到理想的治療效果。

另外，在選擇高敏藥物進(jìn)行治療時(shí)，還要考慮這些高敏藥物的吸收途徑，因?yàn)槲覀兯龅乃幟粼囼?yàn)是藥液直接和細(xì)菌接觸，而在給雞用藥時(shí)，必須通過機(jī)體的吸收才能使藥物達(dá)到一定的效果，所以在給雞用藥時(shí)，高敏藥物一定要配合適宜的給藥途徑，這樣才能達(dá)到最好的治療效果。

3.2.2 聯(lián)合用藥

主要是利用抗菌增效劑與某些藥物的協(xié)同作用。通過聯(lián)合用藥可以擴(kuò)大抗菌譜，增強(qiáng)療效、減小藥物用量、降低或避免毒副作用，進(jìn)而減少或延緩耐藥菌株的產(chǎn)生。

3.2.3 應(yīng)用中草藥治療

許多中草藥具有抑制和殺滅細(xì)菌作用，清熱解毒類中藥也廣泛用于防治感染類疾病，并具有較好療效和較低毒副殘留及抗藥性等優(yōu)點(diǎn)。

3.2.4 應(yīng)用微生態(tài)制劑治療

微生態(tài)制劑可以促進(jìn)雞體內(nèi)正常微生物菌群的建立，使得正常菌群占據(jù)整個(gè)消化道，而后進(jìn)入的致病菌就難以在消化道壁上找到附著點(diǎn)，從而競爭性地抑制了致病性大腸桿菌的生存。

4 小結(jié)

4.1 對鶴壁市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供的20株雞源大腸桿菌菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明：青霉素、四環(huán)素、林可霉素、環(huán)丙沙星、紅霉素、蒽諾沙星嚴(yán)重耐藥；頭孢唑啉、諾氟沙星、卡那霉素中敏；氟苯尼考、阿米卡星、頭孢曲松高敏，因此，臨床上應(yīng)選擇上述高敏藥物進(jìn)行治療。

4.2 近年來，由于人們對抗生素的廣泛大量應(yīng)用，使得一些藥物過去有效而現(xiàn)在無效；或者在這個(gè)雞場有效而在另外一個(gè)雞場無效；并且其產(chǎn)生耐藥性的速度也比較快。因此，在臨床用藥過程中我們應(yīng)當(dāng)先做藥敏試驗(yàn)，篩選出高敏藥物，且選擇正確的給藥途徑，將這些高敏藥物交替或聯(lián)合使用，同時(shí)大力推廣應(yīng)用中草藥和微生態(tài)制劑進(jìn)行治療，再配合科學(xué)的飼養(yǎng)管理和加強(qiáng)環(huán)境消毒等措施，以達(dá)到最佳的治療效果，從而減少其耐藥機(jī)率的發(fā)生。