閆宏斌， 鄭善鑾， 郝曉柯

(第四軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院檢驗科，陜西西安710032)

凝血酶原時間(prothrombin time，PT)、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT)、凝血酶時間(thrombin time，TT)纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)IB)、D-二聚體(D-dimer，DD)和纖維蛋白原降解產(chǎn)物(fibrinogen degradation product，F(xiàn)DP)的聯(lián)合檢測，可以更全面了解人體凝血系統(tǒng)和纖溶系統(tǒng)的功能，特別是在出血性疾病和血栓病方面有重要的臨床意義。我們對新引進的SYSMEX CS5100全自動血凝分析儀(簡稱CS5100)進行了全面的性能評價，并在此基礎(chǔ)上建立了本實驗室的臨床參考區(qū)間。

材料和方法

一、研究對象

收集陜西地區(qū)健康成人222名血漿樣本，其中男120例，女102例，年齡20～79歲。均為2013年5至6月來第四軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院體檢中心進行體檢的健康體檢者，經(jīng)查看最終體檢報告篩選各項檢測指標(biāo)均未見異常改變。參照臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)H21-A5 文件［1］規(guī)定采集血漿，將枸櫞酸鈉(0.11 mol/L)1份與靜脈全血9份混合，為避免產(chǎn)生氣泡，1500×g離心10～15min分離出血漿樣本待檢。

二、儀器和試劑

CS5100(日本 SYSMEX公司)。德國SIEMENS 公司 PT、APTT、TT、FIB、DD 試劑盒、質(zhì)控品、緩沖液。日本一化FDP試劑盒、質(zhì)控品。

三、方法

1.精密度試驗 參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS)EP5-A2 文件的要求，分別選取正常和異常的質(zhì)控品或混合血漿檢測 PT、APTT、TT、FIB、DD和 FDP，了解儀器的重復(fù)性。(1)批內(nèi)精密度:用同一批號的試劑對正常和異常3個水平混合血漿檢測，2 h內(nèi)連續(xù)測定10次，計算批內(nèi)均值()、標(biāo)準(zhǔn)差(s)和變異系數(shù)(coefficient of variation，CV);(2)批間精密度:選取3個水平質(zhì)控品近20 d的質(zhì)控數(shù)據(jù)，計算20 d質(zhì)控數(shù)據(jù)、s和CV。

2.準(zhǔn)確性試驗 CS5100經(jīng)校準(zhǔn)、日常維護保養(yǎng)后，使用配套德靈各水平的定值質(zhì)控品，PT、APTT為3個水平，F(xiàn)IB、TT為1個水平，DD、FDP為2個水平，驗證其準(zhǔn)確性，重復(fù)測定3次，對測定的數(shù)據(jù)計算出相對偏倚(Bias%)。

3.線性范圍試驗 根據(jù)CLSI對線性評價的要求，選取多個高濃度患者的血漿充分混合，重復(fù)測定5次，取平均值作為接近預(yù)期上限的高濃度血漿(H)，用配套稀釋液分別按100%、80%、60%、40%、20%、0%進行稀釋，分別測定FIB、DD和FDP，每個稀釋度重復(fù)測定2次，計算相關(guān)系數(shù)(r)值。

4.血漿樣本攜帶污染率試驗 將精密度驗證的質(zhì)控品水平3的8、9、10號結(jié)果標(biāo)示為H1、H2、H3，質(zhì)控品水平 1 的 1、2、3 號結(jié)果標(biāo)示為L1、L2、L3，按公式求攜帶污染率。

5.可比性實驗 用該儀器與廠家已知性能經(jīng)過校正的SYSMEX CA7000(A2390)分析系統(tǒng)［簡稱CA7000(A2390)］平行檢測20份血漿，其中包含正常、異常的樣本，進行PT、APTT、FIB、TT等6個項目的對比，按1→20、20→1排序檢測2次，檢測后對檢測結(jié)果進行相關(guān)性分析。

6.參考區(qū)間驗證 嚴格按照試劑說明書進行試劑配置，用CS5100對選取的表面健康者222名進行PT、APTT、TT 、FIB 、DD和FDP檢測，計算r值(落在參考范圍內(nèi)的樣本數(shù)/總的試驗樣本數(shù))，要求r＞0.95。檢測前和檢測時均用正常和異常質(zhì)控進行監(jiān)控，須在樣本采集后2 h內(nèi)完成檢測。

7.參考區(qū)間的確立 對于未通過參考區(qū)間驗證的項目，根據(jù)222例樣本檢測結(jié)果計算95%可信區(qū)間。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料呈正態(tài)分布，用±s表示。兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、精密度試驗

CS5100的重復(fù)性和穩(wěn)定性檢測結(jié)果見表1、表2。各項目批內(nèi) CV 均＜3.0%，PT、APTT、TT和FIB的批間 CV＜5.0%，DD和 FDP的批間CV＜6.3% 符合CLIA'88提出的血凝分析儀指標(biāo)質(zhì)量分析要求。

表1 CS5100重復(fù)性測定結(jié)果(批內(nèi))

表2 CS5100重復(fù)性測定結(jié)果(批間)

二、準(zhǔn)確度實驗

根據(jù)NCCLS相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，PT、APTT、FIB的總允許誤差分別為±15% 、±15%、±20%，TT、DD和FDP的總允許誤差暫參照FIB標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。結(jié)果顯示，CS5100的偏差均在允許誤差范圍內(nèi)。見表3。

三、線性實驗

各濃度的DD、FIB和FDP測定值和標(biāo)準(zhǔn)值之間具有良好的線性關(guān)系，r值分別為0.997 4、0.999 8、0.996 8，均＞0.975，表明測定值和理論值高度相關(guān)，a 值分別為0.983 0、1.022 4、0.990 6，在所要求的1±0.05范圍內(nèi)，見圖1。

表3 CS5100準(zhǔn)確度實驗測定結(jié)果

圖1 CS5100線性實驗

四、攜帶污染實驗

PT、APTT、TT、FIB、DD和 FDP 的攜帶污染率均＜2.0%，見表4。儀器自潔系統(tǒng)良好。

五、與CA7000(A2390)的比對

2 種系統(tǒng)對 PT、APTT、TT、FIB、DD和 FDP 的回歸方程的R2均＞0.975，回歸斜率＞0.95而＜1.05。見圖2。

表4 CS5100攜帶污染率

圖2 CS5100與CA7000(A2390)的能力比對線性回歸圖

六、參考區(qū)間驗證結(jié)果

TT、DD和FDP的r均＞0.95，表明廠家推薦的參考區(qū)間適用于本實驗室。PT、APTT、FIB的r＜0.95，其推薦參考區(qū)間不符合本實驗室參考區(qū)間要求，需要重新建立PT、APTT、FIB的實驗室參考區(qū)間。見表5。

七、PT、APTT、FIB實驗室參考區(qū)間的建立

對222名健康體檢者的生理、生化指標(biāo)的觀察值采用正態(tài)分布法，求PT、APTT、FIB的95%參考區(qū)間的上下限。PT的下限值為－1.96s=11.66－1.96×0.658≈10.4，PT的上限值為+1.96s=11.66+1.96×0.658≈13.0，本實驗室PT參考區(qū)間為10.4～13.0 s。APTT的下限值為－1.96s=24.91－1.96×2.761≈19.5，APTT的上限值為+1.96s=24.91+1.96×2.761≈30.3，本實驗室APTT(以白陶土為激活劑)參考區(qū)間為19.5～30.3 s。FIB的下限值為－1.96 s=2.60－1.96× 0.489≈1.6，F(xiàn)IB 的上限值為+1.96 s=2.60－1.96×0.489≈3.6，本實驗室 FIB 參考區(qū)間為1.6～3.6 g/L。

八、222名不同性別健康成人凝血指標(biāo)的檢測結(jié)果

不同性別健康成人凝血各指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表6。

表5 CS5100參考區(qū)間驗證結(jié)果

表6 性別分組凝血指標(biāo)結(jié)果比較(±s)

表6 性別分組凝血指標(biāo)結(jié)果比較(±s)

女性組 102 11.6±0.70 24.8±2.1 2.58±0.59 17.8±2.13 0.08±0.09 0.50±0.43 P值＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05

討 論

目前，國內(nèi)越來越多的醫(yī)院已經(jīng)采用了全自動血凝分析系統(tǒng)，而且隨著科技的發(fā)展，全自動血凝儀為我們提供了高性能、高精密度和高效率的自動化分析水平，同時也準(zhǔn)確地為臨床提供有價值的檢驗結(jié)果。盡管血凝儀在裝機時儀器廠商已提供了儀器性能的初步參數(shù)，但由于各實驗室之間的差異，在儀器使用前必須對性能參數(shù)重新評估。本研究參照國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(International Council for Standardization in Haematology，ICSH)制定的評價內(nèi)容，對CS5100進行精密度、準(zhǔn)確度、線性范圍、攜帶污染率、比對實驗等方面的評價。研究表明，以CLIA'88的室間質(zhì)評能力(PT)為參考標(biāo)準(zhǔn)［2］，TT、DD和 FDP由于無室間質(zhì)評能力要求，因此TT、DD和FDP批內(nèi)CV參照廠家標(biāo)準(zhǔn)，批間參照FIB標(biāo)準(zhǔn)(本實驗室對TT、DD和FDP的室內(nèi)質(zhì)控經(jīng)過2年的累計，發(fā)現(xiàn)與FIB的CV很接近，故暫按FIB的室間質(zhì)評標(biāo)準(zhǔn)判斷)進行評價。PT、APTT的批內(nèi)CV符合規(guī)定允許誤差(3.75%)的1/4，F(xiàn)IB的批內(nèi)CV符合允許誤差(5.0%)的1/4，TT、DD和FDP的批內(nèi)CV允許值符合廠家標(biāo)準(zhǔn)(10.0%、7.8%、10.0%)。PT、APTT 的批間 CV 符合允許誤差(5.0%)的 1/3，TT、FIB、DD和 FDP 的批間 CV符合允許誤差(6.67%)的1/3，說明該儀器具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。準(zhǔn)確度實驗表明偏差在允許范圍內(nèi)，提示儀器具有較高的準(zhǔn)確度。線性實驗和攜帶污染實驗也表明儀器具有良好的檢測線性關(guān)系和自潔系統(tǒng)，比對實驗中可見與CA7000(A2390)的相關(guān)性良好，保證了實驗室結(jié)果的一致性。各實驗室均應(yīng)根據(jù)自己實驗條件的不同建立自己實驗室的參考區(qū)間［3］。此外，由于各實驗室在儀器、試劑、環(huán)境和地域人群等方面有所不同，所以本實驗室進一步建立了適用于自己實驗室的參考區(qū)間。首先對廠家推薦的PT、APTT、TT、FIB、DD和FDP的參考區(qū)間進行驗證，以結(jié)果r＞0.95為判斷標(biāo)準(zhǔn)，TT、DD和FDP的推薦參考區(qū)間適用于本實驗室，而PT、APTT、FIB的r值分別為0.81、0.81、0.91，因此通過統(tǒng)計方法計算其參考區(qū)間分別為10.4～13.0 s、19.5～30.3 s、1.6～3.6 g/L。此外，男、女之間血凝指標(biāo)各參數(shù)值的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，與相關(guān)文獻報道一致。

PT、APTT分別為外源性和內(nèi)源性凝血因子的首要檢測指標(biāo)［4］，TT主要是對血中循環(huán)抗凝物質(zhì)如肝素等的篩查［5］，F(xiàn)IB主要用于纖溶篩查［6］，DD不僅可作為急性腦梗死病程判斷及療效觀察的有用指標(biāo)［7］，而且還是一種最簡便、可靠的急性肺栓塞篩選指標(biāo)［8］，DD在臨床上已被視為體內(nèi)高凝狀態(tài)和纖溶亢進的分子標(biāo)志物，對高凝狀態(tài)和血栓性疾病的診斷及預(yù)后判斷有一定實用價值，F(xiàn)DP聯(lián)合DD檢測可以區(qū)分原發(fā)和繼發(fā)性的纖溶亢進，上述6種指標(biāo)不僅可用于凝血功能的篩選，而且可應(yīng)用于口服抗凝藥物的監(jiān)控、肝素和溶栓治療的監(jiān)控以及彌漫性血管內(nèi)凝血的篩查等，因此，本研究在進行系統(tǒng)的儀器性能評估后，進一步驗證了廠家推薦的參考區(qū)間，建立起適用于本實驗室的臨床凝血項目參考區(qū)間，旨在為臨床提供更加精準(zhǔn)、可靠、有價值的檢驗結(jié)果，在協(xié)助臨床診斷、療效觀測方面具有重要意義。

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