西安醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院（西安710021） 封懷安 王 康 魏光兵

腹膜粘連是腹、盆腔手術(shù)后常見(jiàn)的并發(fā)癥，其發(fā)生率為79%～93%［1］。目前多認(rèn)為是手術(shù)創(chuàng)傷、感染、異物反應(yīng)、組織缺血、局部放療或化療等的結(jié)果［2］。腹腔粘連患者中約40%發(fā)生不同程度的腸梗阻，是急性復(fù)發(fā)性腸梗阻的最常見(jiàn)原因，并與女性不育、腹痛和盆腔痛直接相關(guān)［3］。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用透明質(zhì)酸鈉進(jìn)行預(yù)防腹膜粘連的實(shí)驗(yàn)研究，旨在探討其對(duì)腹膜粘連的預(yù)防效果。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料 選用健康S-D（Sprague Dawley）大鼠60只，雌雄各半，體重250～300g（由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉由上海華源生命科學(xué)研究開(kāi)發(fā)有限公司提供。

2 方 法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備及分組

A組：創(chuàng)傷組20只，術(shù)前禁食10～12h，以2%戊巴比妥鈉30mg／kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定于鼠板上，取下腹正中入腹，在右髂窩處找到膨大的盲腸，用止血鉗鉗夾盲腸壁及相對(duì)壁腹膜，直至點(diǎn)狀出血，面積約1.5cm×2.5cm，順腸管走形排列好腸袢，保證受傷的腹膜腸管相對(duì)在一起，避免損傷其它臟器及腹膜，逐層關(guān)腹。術(shù)后禁食12h，用標(biāo)準(zhǔn)顆?；旌巷暳希ㄓ晌靼步煌ù髮W(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）喂養(yǎng)。

B組：創(chuàng)傷+透明質(zhì)酸鈉組20只，按照A組方法建立創(chuàng)傷模型于關(guān)腹前在創(chuàng)傷部位均勻涂抹醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉約1ml，術(shù)后喂養(yǎng)同A組。

C組：對(duì)照組20只，僅行開(kāi)關(guān)腹手術(shù)，術(shù)后喂養(yǎng)同前。

2.2 觀察與檢測(cè)指標(biāo)

2.2.1 觀察粘連情況及組織標(biāo)本的采集：分別于術(shù)后第1、3、5、7d脫臼處死動(dòng)物，打開(kāi)腹腔，肉眼觀察粘連情況及程度，按照Nair［4］粘連分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，0級(jí)：完全無(wú)粘連；1級(jí)：?jiǎn)蝹€(gè)纖細(xì)粘連；2級(jí)：?jiǎn)蝹€(gè)或兩個(gè)輕度粘連，粘連寬度＜1㎝；3級(jí)：重度粘連，兩個(gè)以上粘連或一個(gè)粘連寬度＞1㎝；4級(jí)：廣泛的或切口下的粘連。分級(jí)后按級(jí)數(shù)打分，0級(jí)為0分，1級(jí)為1分，依此類(lèi)推4級(jí)為4分。然后，切取粘連或損傷組織（包括一部分腸管和相對(duì)的腹膜），10%甲醛浸泡24h后常規(guī)石蠟包埋，待檢。

2.2.2 鏈霉親和素免疫組化法（Strept-Avidin-Biotin-enzyme Complex，SABC）檢測(cè)TGF-β1：按照說(shuō)明書(shū)操作，TGF-β1免疫組化試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，陰性對(duì)照由PBS替代一抗，由已證實(shí)的陽(yáng)性片作對(duì)照。用Q5SOCW圖像信號(hào)采集與分析系統(tǒng)檢測(cè)灰度值，每張切片隨意取3個(gè)不同視野檢測(cè)，取其平均值。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，粘連分級(jí)評(píng)分采用秩和檢驗(yàn)，免疫組化染色結(jié)果比較采用方差分析，以P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 粘連評(píng)分結(jié)果 A組有1只大鼠術(shù)后第1天內(nèi)死亡，尸檢可見(jiàn)：腹腔廣泛混濁污液，有惡臭，鉗夾的盲腸有穿孔，肝脾腎均有壞死灶，腹腔無(wú)粘連形成，分析死于中毒性休克。其余動(dòng)物粘連評(píng)分見(jiàn)表1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，術(shù)后1、3d粘連評(píng)分無(wú)明顯差異（P＞0.05），3、5、7d間粘連評(píng)分有顯著性差異（P＜0.05）。說(shuō)明術(shù)后3～7d是粘連形成的關(guān)鍵時(shí)期。

B組粘連評(píng)分見(jiàn)表2，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)1、3、5、7d粘連分級(jí)無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。本組5、7d粘連評(píng)分明顯低于A組同時(shí)間點(diǎn)粘連評(píng)分（P＜0.05）。這說(shuō)明透明質(zhì)酸鈉可減少術(shù)后腹膜粘連的程度。

C組動(dòng)物無(wú)粘連形成，評(píng)分見(jiàn)表3。

2 免疫組化結(jié)果 A、B組TGF-β1表達(dá)定位于粘連組織的巨噬細(xì)胞中，呈較一致的陽(yáng)性反應(yīng)，棕黃色的陽(yáng)性物質(zhì)都沉積于巨噬細(xì)胞的胞漿中；對(duì)照組TGF-β1同樣定位于組織的巨噬細(xì)胞中，但呈弱陽(yáng)性的反應(yīng)或不表達(dá)，由表4和附圖可見(jiàn)三組染色灰度值結(jié)果。A、B組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)灰度值均較對(duì)照組低（P＜0.01），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，B組較A組表達(dá)明顯減少（P＜0.01）。由此可見(jiàn)，透明質(zhì)酸鈉能明顯減少術(shù)后粘連組織中TGF-β1的表達(dá)，有一定的防粘連作用。

表1 A組動(dòng)物腹膜粘連情況（只）

表2 B組動(dòng)物腹膜粘連情況（只）

表3 C組動(dòng)物腹膜粘連情況（只）

附圖 各組術(shù)后TGF-β1的表達(dá)灰度值

表4 各組術(shù)后TGF-β1表達(dá)灰度值（±s）

表4 各組術(shù)后TGF-β1表達(dá)灰度值（±s）

組別 1d 3d 5d 7d A組 191.60±5.14 188.24±2.42 165.08±1.54 165.68±1.57 B組 210.99±0.80 206.46±1.90 199.98±0.64 199.92±0.58 C組 215.31±0.92 214.04±1.09 213.16±0.80 212.95±0.88

討 論

我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中動(dòng)態(tài)觀察大鼠腹膜粘連形成時(shí)發(fā)現(xiàn)，在腹膜粘連形成的自然過(guò)程中，術(shù)后第1天和第3天的粘連評(píng)分沒(méi)有差異，而3、5、7d時(shí)的粘連評(píng)分是有顯著性差異的，說(shuō)明粘連形成的關(guān)鍵時(shí)期是術(shù)后3～7d。這提示我們，預(yù)防腹膜粘連的藥物應(yīng)在此時(shí)間段發(fā)揮作用。

透明質(zhì)酸是一種酸性粘多糖。它是人體內(nèi)的一種正常的糖胺聚糖，分布于人體結(jié)締組織細(xì)胞外基質(zhì)中，在生理濃度時(shí)，透明質(zhì)酸分子相互纏繞并形成無(wú)序纖維網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)成其特有的三維結(jié)構(gòu)，有些大分子，如纖維蛋白原、膠原和蛋白多糖是很難進(jìn)入網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的。它以膠體狀態(tài)進(jìn)入腹腔，接觸到損傷的腹膜后，形成一種膠凍狀物質(zhì)，覆蓋于受損傷腹膜的表面，從而隔離開(kāi)受損傷腹膜面的直接有效接觸。透明質(zhì)酸鈉是透明質(zhì)酸的鈉鹽形式，是一種天然降解具有吸收性的生物醫(yī)學(xué)材料。一般術(shù)后腹膜粘連形成需要7d左右，我們的實(shí)驗(yàn)觀察在術(shù)后7d仍見(jiàn)有未完全降解的透明質(zhì)酸鈉。可見(jiàn)透明質(zhì)酸鈉真正起到了良好的隔離作用。本試驗(yàn)結(jié)果顯示透明質(zhì)酸鈉明顯降低了腹腔粘連程度。

TGF-β是啟動(dòng)和終止組織修復(fù)的一種主要細(xì)胞因子，是細(xì)胞生長(zhǎng)的雙向調(diào)節(jié)劑［5］，哺乳動(dòng)物中TGF-β有三種類(lèi)型，即 TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，不同的器官表達(dá)不同的TGF-β，表達(dá)量與粘連形成有關(guān)，腹腔器官、漿膜組織及粘連部位表達(dá)TGF-β1、TGF-β3增多，其中TGF-β1在組織損傷中效應(yīng)最強(qiáng)，在腹膜粘連過(guò)程中有重要作用。它能向臨近細(xì)胞發(fā)出信號(hào)，調(diào)節(jié)損傷組織重建的全過(guò)程。在腹膜粘連過(guò)程中，TGF-β可能在損傷、炎癥及纖維化之間起橋梁作用［6］，腹膜損傷后血小板和巨噬細(xì)胞釋放TGF-β，啟動(dòng)一個(gè)連鎖反應(yīng)，破壞了纖維蛋白溶解與合成之間的平衡，同時(shí)還導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，從而促進(jìn)了腹膜粘連的形成。在本實(shí)驗(yàn)中我們證實(shí)應(yīng)用透明質(zhì)酸鈉組動(dòng)物腹膜損傷部位的TGF-β1表達(dá)明顯低于創(chuàng)傷組，說(shuō)明透明質(zhì)酸鈉對(duì)TGF-β1的表達(dá)有明顯的抑制作用，從而證明透明質(zhì)酸鈉預(yù)防術(shù)后腹膜粘連形成的一條重要機(jī)制在于抑制損傷組織中細(xì)胞因子的水平，尤其是TGF-β1的表達(dá)水平，從而起到抗粘連的作用。

總之，本實(shí)驗(yàn)初步認(rèn)為透明質(zhì)酸鈉預(yù)防術(shù)后腹膜粘連的機(jī)制可能在于：①透明質(zhì)酸鈉能在損傷局部起到良好的隔離作用；②減少損傷局部的炎細(xì)胞滲出，減少膠原蛋白的沉積，促進(jìn)損傷組織的生理性修復(fù)；③透明質(zhì)酸鈉能夠抑制損傷組織愈合過(guò)程中TGF-β1的過(guò)量合成及表達(dá)。

［1］Rout UK，Diamond MP.Role of plasminogen activators during healing after ulterine Serosal lesioning in the rat［J］.Fertil Steril，2003，79（1）：138-145.

［2］Liakakos T，Thomakos N，F(xiàn)ine PM，et al．Peritoneal adhesions：Etiology，pathophysiology，and clinical significane.Recent advances in prevention and management［J］.Di Surg.2001，18（1）：260-273.

［3］Greene AK，Alwayn IP，Nose V，et al.Prevention of intra-abdominal adhesions usingthe antiangiogenic COX-2 inhibitor celecoxib［J］.Ann Surg，2005，242（1）：140-146.

［4］Tsai SW，F(xiàn)ang JF，Yang CL，et al.Preparatioin and evaluation of hyaluronate-collagen film for preventing postsurigal adhesion［J］.Int Med Res，2005，33（1）：68.

［5］Herndon DN，Nguyen TT，Gilpin DA.Growth factors local and systemic［J］.Arch Surg，2003，128：1227-1233.

［6］翁永強(qiáng).β-生長(zhǎng)因子與腹膜粘連［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)，2000，27（2）：94-96.