胡玉華，顏 凌，劉子酉，席淑華

（1.廈門醫(yī)學高等?？茖W校，福建 廈門 361000；2.中國醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，遼寧 沈陽 110001）

地方性氟中毒是我國發(fā)病最廣、人口最多、病情最重的地方病之一，有病區(qū)縣1380 個，受威脅人口達1.25 億［1］。氟中毒除了引起氟斑牙和氟骨癥外，一些氟中毒患者常伴有神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，表現(xiàn)為頭痛、頭暈、記憶力減退等中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙癥狀。氟離子可以通過血腦屏障在腦組織中蓄積［2］，氟的反應活性極強，可直接攻擊氧，干擾氧代謝，影響抗氧化酶的活性，導致活性氧（ROS）、自由基增多?；钚匝跖c自由基已被認為是氟引起腦損傷的基礎。

小膠質(zhì)細胞是腦組織中的免疫細胞，一些內(nèi)外因素均可使其激活，活化后的小膠質(zhì)細胞可通過NADPH 氧化酶（還原型煙酰胺嘌呤二核苷酸磷酸）產(chǎn)生大量的ROS。NADPH氧化酶在小膠質(zhì)細胞高表達，是催化生成超氧陰離子自由基（O2·-）的主要酶類。本研究以小鼠小膠質(zhì)細胞（BV-2細胞）為受試對象，通過加入NADPH 氧化酶抑制劑后測定氟處理BV-2細胞ROS產(chǎn)生情況，了解NADPH 氧化酶在氟作用下小膠質(zhì)細胞ROS產(chǎn)生中的作用，為氟致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷機制的研究提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超凈工作臺（江蘇蘇凈集團公司）；150 型二氧化碳（CO2）恒溫培養(yǎng)箱（荷蘭Heraeus公司）；倒置顯微鏡（Nikon公司）；流式細胞儀（FACScan）。氟化鈉（NaF，上海生工生物工程有限公司）；MTT（美國Hyclone公司）；NADPH 氧化酶抑制劑API（Santa Cruz Biotechnology 公司）；硝基酪氨酸（NT）試劑盒（北京安必維抗體技術(shù)有限公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)

小鼠小膠質(zhì)細胞（BV-2）由中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎醫(yī)學細胞中心提供。細胞常規(guī)培養(yǎng)于DMEM 高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，1×105U／L 青、鏈霉素），5% CO237℃條件下培養(yǎng)。待細胞達到70%～80%融合時進行1：3傳代，本實驗細胞采用2d換液，3d傳代一次的方法。

1.3 細胞增殖活力的測定

用0.25%的胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細胞，用含10%的胎牛血清的培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，將細胞以1×104個／孔的密度接種于96孔板中，每孔體積200μL。將96孔板放入CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2～3d后，加入濃度為0、1、5、10、25、50、100mg／L 的氟化鈉，分別在染毒6、12、48h，加入MTT 溶液，用酶標儀測定各孔吸光度，測定波長為490 nm。細胞活力用MTT 的還原率表示。

1.4 細胞內(nèi)ROS檢測

將細胞以4×104個／mL 的密度接種于6 孔板，于5%CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2～3d后，加入濃度為0，1，5，10，25，50，100mg／L 的氟化鈉，染毒6，12h和24h后加入熒光探針（DCFH-DA），37℃孵育30min，用流式細胞儀對細胞內(nèi)ROS含量進行檢測。對NADPH 氧化酶抑制劑處理的細胞，在細胞生長約60%時，加入100μm NADPH 氧化酶抑制劑API，2h之后加入濃度50mg／L NaF 處理24h，加入熒光探針（DCFH-DA），37℃孵育30min，用流式細胞儀對細胞內(nèi)ROS 含量進行檢測。激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長530nm，以DCF的平均熒光強度表示ROS生成量。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0for Windows軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析（ANOVA）進行組間比較，組間兩兩比較采用LSD 檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 氟化鈉對BV-2細胞增殖活力的影響

BV-2細胞染毒6h后，100mg／L NaF 染毒組細胞增殖活力顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），但在1和5mg／L NaF處理組，細胞增殖活力出現(xiàn)一個顯著升高現(xiàn)象，之后，隨染氟劑量的增加細胞增殖活力顯著降低；染毒12h后，10、100mg／L NaF染毒組細胞增殖活力顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；染毒24h后，1、5、10、100mg／L NaF染毒組細胞增殖活力顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 氟化鈉對BV-2細胞增殖活力的影響（±s，n=3）

表1 氟化鈉對BV-2細胞增殖活力的影響（±s，n=3）

注：＊與對照組相比，P＜0.05；＃ 與對照組相比，P＜0.01。

2.2 氟化鈉對BV-2細胞中ROS含量的影響

BV-2細胞染毒6h后，5mg／L NaF以上染毒組細胞內(nèi)ROS含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；染毒12h后，10mg／L NaF以上染毒組細胞內(nèi)ROS含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；染毒24h后，50、100mg／L NaF染毒組細胞內(nèi)ROS含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表2。

表2 氟化鈉對BV-2細胞內(nèi)ROS含量的影響（±s，n=3）

表2 氟化鈉對BV-2細胞內(nèi)ROS含量的影響（±s，n=3）

注：＊與對照組比較，P＜0.05，＃ 與對照組比較，P＜0.01。

2.3 NADPH 氧化酶對氟化鈉暴露的BV-2細胞ROS水平的影響

我們先前的研究已發(fā)現(xiàn)氟能引起小膠質(zhì)細胞ROS水平增加［3］，因此，為檢測氟引起的ROS水平增高是否由NADPH 氧化酶引起，我們加入NADPH 氧化酶抑制劑API與氟共同處理小膠質(zhì)細胞，發(fā)現(xiàn)API能夠顯著降低NaF 誘導的BV-2細胞內(nèi)ROS含量，見表3。

表3 NADPH 氧化酶抑制劑對氟處理的BV-2細胞ROS含量的影響（±s，n=3）

表3 NADPH 氧化酶抑制劑對氟處理的BV-2細胞ROS含量的影響（±s，n=3）

注：a 與0mg／L NaF染毒組比較，P＜0.01；b 與50mg／L NaF染毒組比較，P＜0.01。API：NADPH 氧化酶抑制劑。

3 討論

由于神經(jīng)系統(tǒng)耗氧率高，腦膜富含易氧化的多不飽和脂肪酸，腦組織中的抗氧化酶活性相對比其他組織低，對氧介導的損傷非常敏感。目前多數(shù)研究認為，氟誘導的氧化應激是氟引起腦損傷的基礎。作為神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細胞，小膠質(zhì)細胞在正常狀態(tài)下處于靜息狀態(tài)，當中樞神經(jīng)微環(huán)境發(fā)生改變時可激活為活化狀態(tài)［4］，抵御外來抗原的侵襲，對機體產(chǎn)生保護作用。然而，過度的活化可釋放過多的炎性因子和ROS等，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷［5，6］。NADPH 氧化酶是介導免疫細胞細胞外超氧化物產(chǎn)生的主要酶，在小膠質(zhì)細胞中高表達。NADPH 氧化酶能夠催化氧分子生成超氧陰離子自由基（O2·-）［7］。本研究發(fā)現(xiàn)，氟處理組細胞內(nèi)ROS的含量顯著高于對照組，并呈顯著的劑量-反應關(guān)系。由此可以推測，氟可誘導ROS水平增高，引起氧化應激。API，一種廣泛使用的NADPH 氧化酶抑制劑，顯著降低了氟引起的小膠質(zhì)細胞內(nèi)ROS含量。說明NADPH 氧化酶參與了氟誘導的小膠質(zhì)細胞氧化應激反應。本研究結(jié)果表明氟可降低小膠質(zhì)細胞活力，引起小膠質(zhì)細胞氧化損傷，NADPH 氧化酶在氟誘導的ROS產(chǎn)生中起一定作用。

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