李 翠，郭彩云，戴志紅，蔣 卉，張秀英，溫 芳，陸連壽，王在時(shí)

（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081）

雞傳染性法氏囊?。↖nfectious of bursal disease，IBD）是由雞傳染性法氏囊病毒（Infectious of bursal disease virus，IBDV）引起的一種急性、高度傳染性疾?。?］，是家禽傳染性疾病中危害最嚴(yán)重的疫病之一［2］。在我國對該病的主要防治措施是對雞群進(jìn)行疫苗免疫［3］，雞傳染性法氏囊病活疫苗（B87株）一直作為國內(nèi)生產(chǎn)使用最為廣泛的雞傳染性法氏囊病疫苗。為控制該疫苗的質(zhì)量，本文研制了參考疫苗作為實(shí)物標(biāo)尺使生產(chǎn)范疇內(nèi)的疫苗效力值標(biāo)準(zhǔn)化。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性是指標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性量值在規(guī)定的時(shí)間間隔和環(huán)境條件下保持在規(guī)定范圍內(nèi)的性質(zhì)，是衡量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量值隨時(shí)間變化的指標(biāo)，特性量值不發(fā)生明顯變化的時(shí)間間隔越長，表明該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性越好。由于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的各項(xiàng)特性值要求均比較高，其制備過程也較為復(fù)雜，所以較長的保存期對于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來說非常重要。通常在較低的保存溫度下生物制品的失活速度很慢，加之生物制品活性出現(xiàn)的細(xì)微下降不易被非常準(zhǔn)確地測定，因此在較低溫度下往往很難在短時(shí)間內(nèi)計(jì)算其有效期。而生物制品在較高溫度下的失活速度很快，所以熱加速穩(wěn)定性試驗(yàn)最常被用來在短時(shí)間內(nèi)比較準(zhǔn)確地預(yù)測生物制品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的有效期［4-5］。本研究首次采用熱加速穩(wěn)定性試驗(yàn)和雞胚半數(shù)致死量（ELD50）測定法測定制備參考疫苗的病毒含量，預(yù)期其貯存有效期，以期為今后此類研究提供參考。

1 材料

1.1 雞傳染性法氏囊活疫苗（B87株）參考品 雞傳染性法氏囊活疫苗（B87株），加入5%蔗糖脫脂牛奶（凍干保護(hù)劑），同時(shí)加入雙抗（終濃度1‰），混勻后定量分裝至安瓿（1 mL／支），迅速冷凍干燥，并采用充氮融封。由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備（批號 201111）。

1.2 SPF雞胚 10～11日齡雞胚均購自梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 試驗(yàn)方案 采用經(jīng)典恒溫?zé)峒铀俜€(wěn)定性試驗(yàn)［6-7］，從幾個(gè)較高溫度下樣品的效價(jià)失活情況計(jì)算其在較低溫度下的貯存有效期［8］。同一批次的參考疫苗隨機(jī)抽取4組樣品，每組40支，分別置于56℃、37℃、25℃、4℃保存，其中4℃保存樣品在4、8、12、18、24、32、44 周時(shí)取樣，其他溫度保存的樣品分別于第0、3天、第1周、2周、3周、4周、6周、8周和之后每半月一次取樣，每次取樣3支，測定樣品ELD50值。每組樣品以分裝凍干后的ELD50值為基準(zhǔn)值，當(dāng)ELD50值下降2個(gè)滴度時(shí)停止該組實(shí)驗(yàn)。

2.2 不同溫度下的衰減速率常數(shù)K的計(jì)算 大部分蛋白質(zhì)或生物制品的活性失活基本上都符合一級反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。將時(shí)間t與相對效力值的對數(shù)lgC進(jìn)行直線回歸，求得各溫度下的直線方程，符合方程lgC＝ -K／2.303t+lgC0，可確定該參考疫苗隨溫度、時(shí)間變化符合一級降解反應(yīng)。根據(jù)直線方程的斜率可求得各試驗(yàn)溫度下的反應(yīng)速度常數(shù)K值［9-10］。

2.3 -30℃下衰減速率常數(shù)K的計(jì)算 不同溫度的衰減速率常數(shù)K與溫度的動(dòng)力學(xué)關(guān)系符合Arrhenius方程［11］K ＝ Ae-E／RT，即 lgK ＝ lgA+ （-E／RT） ，式中：T為絕對溫度，R為摩爾常數(shù)，E為活化能，A為指前因子。對某一具體反應(yīng)常數(shù)K為速率常數(shù)，是化學(xué)反應(yīng)的一個(gè)特征數(shù)值，與濃度無關(guān)。將56℃、37℃、25℃、4℃下衰減速率常數(shù)K按Arrhenius方程擬合出線性回歸方程，據(jù)此求出-30℃下的K值［12］。

2.4 -30℃下貯存有效期的計(jì)算 根據(jù)-30℃下的衰減速率常數(shù)K及方程lgC＝-K／2.303t+lgC0，即可計(jì)算出樣品效力值由初始效力值降低到目標(biāo)效力值所需的時(shí)間，即為該樣品的貯存有效期。

2.5 長期穩(wěn)定性監(jiān)測 隨機(jī)抽取-30℃下保存1年的參考疫苗3支，測定其ELD50值，以后每隔1年監(jiān)測一次。

3 結(jié)果

3.1 不同溫度下的熱加速試驗(yàn)結(jié)果 參考疫苗在不同溫度和不同時(shí)間條件下病毒含量的測定結(jié)果見表1，結(jié)果表明，參考疫苗的保存溫度越高，效價(jià)下降的速率越快。

表1 不同溫度和不同時(shí)間下熱加速穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3.2 不同溫度下的衰減速率常數(shù)K 將不同溫度下的熱加速穩(wěn)定性數(shù)據(jù)按公式lgC＝-K／2.303t+lgC0計(jì)算不同溫度下的衰減速率常數(shù)K，結(jié)果見表2。

表2 不同溫度下的衰減速率常數(shù)K

3.3 -30℃下衰減速率常數(shù)K的計(jì)算 將不同溫度下衰減速率常數(shù)K按公式Arrhenius方程擬合出線性回歸方程為 lg（-K） ＝-3364.6／T+10.545。據(jù)此求出-30℃下的K值為-0.0188。

3.4 -30℃下貯存有效期的計(jì)算 根據(jù)-30℃下的衰減速率常數(shù) K值及公式 lgC＝-K／2.303t+lgC0，計(jì)算出參考疫苗效力值下降1個(gè)滴度所需的時(shí)間為2.4年。

3.5 長期穩(wěn)定性監(jiān)測 -30℃下保存1年的3支參考疫苗lgELD50值分別為4.33、4.21和4.19，未發(fā)生明顯下降，與熱加速穩(wěn)定性試驗(yàn)預(yù)期結(jié)果一致。

4 討論

國外有文獻(xiàn)報(bào)道，熱加速穩(wěn)定性試驗(yàn)是預(yù)測生物制品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性最常用的方法。該方法是根據(jù)幾個(gè)較高溫度下樣品效價(jià)快速失活的速率以Arrhenius方程預(yù)測其在較低溫度下的貯存有效期［8］。根據(jù)Arrhenius方程擬合線性回歸必須至少需要3個(gè)溫度點(diǎn)的要求，而且要根據(jù)制品在幾個(gè)溫度點(diǎn)的失活數(shù)據(jù)擬合線性回歸得到比較準(zhǔn)確的K值，所以需要科學(xué)選擇試驗(yàn)的溫度點(diǎn)，若溫度點(diǎn)間隔較小，則K值隨溫度變化不明顯，若溫度太高以致失活太快，則該溫度下失活的有效數(shù)據(jù)太少，都會(huì)導(dǎo)致擬合線性回歸不理想［8］。在本研究中，設(shè)定了56℃、37℃、25℃、4℃為溫度點(diǎn)，56℃溫度太高，該溫度下失活的有效數(shù)據(jù)太少，另外3個(gè)溫度點(diǎn)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)按Arrhenius方程擬合出線性回歸方程，說明溫度點(diǎn)的選擇是合適的。

國內(nèi)也有研究以老化試驗(yàn)預(yù)測生物制品穩(wěn)定性，即根據(jù)37℃條件下樣品效價(jià)失活速率預(yù)測其在較低溫度下的貯存有效期，該方法只設(shè)1個(gè)溫度點(diǎn)，而熱加速穩(wěn)定性試驗(yàn)至少需要3個(gè)溫度點(diǎn)，再根據(jù)Arrhenius方程擬合線性回歸計(jì)算樣品在較低溫度下的貯存有效期，理論上熱加速穩(wěn)定性試驗(yàn)更科學(xué)、有效。

熱加速穩(wěn)定性試驗(yàn)所選擇的測定方法需要有足夠的靈敏度、精密度和重復(fù)性，而且要保證每個(gè)溫度下的測定次數(shù)不少于3次，所以測定時(shí)需選擇適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔，可在熱加速初期密集測定，再根據(jù)下降趨勢調(diào)整測定頻率［13］。本試驗(yàn)采用雞胚半數(shù)致死量測定法計(jì)算樣品ELD50值，并按先密后疏的策略選擇適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔，這樣既能檢測到效價(jià)的細(xì)微下降，又能檢測到大的下降趨勢，也保證了總的檢測次數(shù)。結(jié)果表明，擬合線性回歸的相關(guān)系數(shù)較好，說明測定方法和時(shí)間間隔的選擇也是合理的。

由于生物制品本身的復(fù)雜性，加之溫度點(diǎn)的選擇、每個(gè)溫度點(diǎn)的測定次數(shù)和每次測定的樣品數(shù)量有限，用熱加速穩(wěn)定性試驗(yàn)預(yù)測制品的貯存有效期必然存在一定局限性，仍不能完全替代長期穩(wěn)定性研究。因此，在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用過程中，可以熱加速穩(wěn)定性試驗(yàn)預(yù)測樣品的貯存有效期為依據(jù)，按需要進(jìn)行實(shí)際貯存溫度下的長期穩(wěn)定性監(jiān)測，以確保標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)實(shí)際使用中的有效性。

［1］鄭建浩.淺談雞傳染性法氏囊病的診斷與防治［J］.畜禽業(yè)，2008，（4）： 82-83.

［2］張七斤，王克恭.傳染性法氏囊病病毒細(xì)胞培養(yǎng)的研究［J］.中國畜禽傳染病，1992， （6）： 50-52.

［3］謝俊玲.雞傳染性法氏囊的綜合防控措施［J］.養(yǎng)禽與禽病防控，2011，（2）：33-34.

［4］Jerne N K， Perry WLM.The stability of biological standards［J］.Bull WHO，1956， 14： 167-182.

［5］Kirkwood TBL.Predicting the stability of biological standards and products［J］.Biomerrics，1977， 33（4）： 736-742.

［6］戴志紅，蔣 卉，李 翠，等.豬瘟病毒陽性血清的熱加速穩(wěn)定性試驗(yàn)［J］.中國獸藥雜志，2013， 47（3）： 7-10.

［7］董文燊，瞿發(fā)林，徐 波.經(jīng)典恒溫加速試驗(yàn)法預(yù)測芍甘膠囊的有效期［J］.藥學(xué)與臨床研究，2011， 19（1）： 87-88.

［8］Kirkwood TBL.Design and analysis of accelerated degradation tests for the stability of biological standardsⅢ.Principles of design ［J］.Journal of Biological Standardization， 1984， 12：215-224.

［9］Tydeman M S， Kirkhood TBL.Design and analysis of accelerated degradation tests for the stability of biological standardsⅠ.Principles of maximum likelihood estimators［J］.Journal of Biological Standardization，1984， 12：195-206.

［10］Marina C R，F(xiàn)ernando R Q，Luis F，et al.Determination of product shelf life and activation energy for tumor necrosis factor-α in cerebrospinal fluid samples［J］.Clin Chem，1996， 42（5）：670-674.

［11］Peleg M，Normand M D，Corradini M G.The arrhenius equation revisited［J］.Crit Rev Food Sci Nutr，2012， 52（9）： 830-851.

［12］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典一部［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：9-68.

［13］Kirkwood TBL， Tydeman M S.Design and analysis of accelerated degradation tests for the stability of biological standardsⅡ.A flexiblecomputer program for data analysis［J］.Journal of Biological Standardization，1984， 12：207-214.