楊修鎮(zhèn)

（山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所，濟(jì)南250022）

甜地丁為豆科植物米口袋Gueldenstaedtia verna（Georgi）A.Bor.的干燥全草，收載于《中華人民共和國(guó)獸藥典》二○一○年版二部，具有清熱解毒的功效［1］，臨床用于癰腫疔瘡，外耳道癤腫，闌尾炎的治療。甜地丁是獸用常用中藥材之一，原標(biāo)準(zhǔn)無薄層鑒別項(xiàng)和含量測(cè)定項(xiàng)，為了更好的控制本品質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)對(duì)甜地丁中槲皮素的薄層鑒別和含量測(cè)定方法進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 儀器和材料 Agilent 1200高效液相色譜儀，槲皮素對(duì)照品，批號(hào)100081-200907，含量為96.5%，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。甜地丁飲片，批號(hào)20120411、20120523、20120618、20120622 購(gòu)自涑玉平民大藥房，批號(hào) 20130311、20130415、20130518、20130524、20130617購(gòu)自濟(jì)南建聯(lián)中藥店，批號(hào)20130722由山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院提供。10批甜地丁飲片經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥系中藥鑒定專家李峰教授鑒定為豆科植物米口袋Gueldenstaedtia verna（Georgi）A.Bor.。硅膠G薄層板分別購(gòu)自煙臺(tái)化學(xué)工業(yè)研究所、青島海洋化工分廠、德國(guó)Merck公司。甲醇為色譜純，流動(dòng)相用水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.2 定性鑒別

1.2.1 對(duì)照品溶液制備 稱取槲皮素對(duì)照品1 mg加甲醇2 mL溶解，即得。

1.2.2 供試品溶液制備 取甜地丁飲片，粉碎，過三號(hào)篩，稱取2 g，加70%乙醇20 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)酉←}酸10 mL使溶解，加熱回流30 min，放冷，用乙醚振搖提取3次，每次10 mL，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，即得。

1.2.3 薄層色譜方法 吸取槲皮素對(duì)照品溶液和供試品溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（7 ∶5 ∶0.5）［2］為展開劑，展開，取出，晾干，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，置紫外燈（365 nm）下檢視。

1.3 含量測(cè)定

1.3.1 高效液相色譜條件［3］色譜柱為C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-0.3%磷酸溶液（50 ∶50），檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm，流速1.0 mL／min，柱溫25℃，進(jìn)樣量 10 μL。

1.3.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取槲皮素對(duì)照品10 mg置100 mL量瓶中，加80%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得100 μg／mL的槲皮素對(duì)照品貯備液。精密量取上述槲皮素對(duì)照品貯備液5 mL，置25 mL量瓶中，用80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得20 μg／mL的槲皮素對(duì)照品溶液。

1.3.3 供試品溶液制備［4］取甜地丁飲片，粉碎，過三號(hào)篩，精密稱取2 g，置具篩錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流2 h，再稱定重量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液20 mL，精密加入25%鹽酸7 mL，置85℃ 水浴中水解30 min，取出，迅速放冷，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.3.4 線性范圍考察［5］精密量取槲皮素對(duì)照品貯備液，用 80%甲醇稀釋成 5、10、20、40、80、100 μg／mL的系列溶液，注入液相色譜儀，在上述高效液相色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)（x，μg／mL），進(jìn)行線性回歸分析。

1.3.5 精密度試驗(yàn)

1.3.5.1 儀器精密度試驗(yàn) 精密吸取20 μg／mL的槲皮素對(duì)照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，在上述高效液相色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同批甜地丁藥材粉末（過三號(hào)篩）約2 g，精密稱定，按1.3.3項(xiàng)下制備樣品溶液，制備6份，在上述高效液相色譜條件下分別進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知槲皮素含量的甜地丁飲片粉末（過三號(hào)篩）1 g，精密加入濃度為20 μg／mL 的槲皮素80%甲醇溶液 50 mL，自“稱定重量，加熱回流2 h”起按供試品溶液制備項(xiàng)制備樣品溶液，平行6份，注入液相色譜儀，在上述高效液相色譜條件下分別進(jìn)行測(cè)定。

1.3.7 耐用性

1.3.7.1 供試品溶液的穩(wěn)定性 取同一供試品溶液，于制備后 0、1、2、4、8、16、24、48 h 注入液相色譜儀，在上述高效液相色譜條件下分別進(jìn)行測(cè)定。

1.3.7.2 色譜條件的微小變動(dòng) 取同一供試品溶液，將流動(dòng)相調(diào)整為甲醇-0.3%磷酸溶液（48 ∶52）、（52 ∶48）；柱溫的調(diào)整為22、28 ℃；流速調(diào)整為0.9、1.1 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)調(diào)整為358、362 nm，并更換不同廠家的同類型色譜柱分別進(jìn)行測(cè)定。

1.3.7.3 供試品溶液制備條件的微小變動(dòng) 取同一批甜地丁飲片，將加熱回流時(shí)間調(diào)整為110、130 min，水解時(shí)間調(diào)整為 25、30 min，其余按供試品溶液制備項(xiàng)制備樣品溶液，注入液相色譜儀，在上述高效液相色譜條件下分別進(jìn)行測(cè)定。

1.3.8 10 批樣品含量測(cè)定 取不同批號(hào)的甜地丁藥材，按1.3.3項(xiàng)下制備樣品溶液，注入液相色譜儀，在上述高效液相色譜條件下分別進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 定性鑒別 供試品色譜中，在對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)有效分離，見圖1。

圖1 甜地丁中槲皮素的薄層鑒別照片

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜分離 在上述高效液相色譜條件下，分析得到對(duì)照品溶液、供試品溶液的色譜圖，從圖2、圖3可知，在所采用的色譜條件下，槲皮素可以得到很好的分離。

圖2 槲皮素對(duì)照品HPLC色譜圖

2.2.6 10批樣品含量測(cè)定 10批甜地丁飲片中槲皮素含量在0.51～1.23 mg／g之間，不同飲片含量差異較大。結(jié)果見表2。

圖3 甜地丁樣品HPLC圖譜

2.2.2 線性范圍考察 回歸方程為：y＝ 18.7190x+2.4276（r＝ 0.9997） 。 結(jié)果表明槲皮素進(jìn)樣濃度在5～100 μg／mL的范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3 精密度試驗(yàn)

2.2.3.1 儀器精密度試驗(yàn) 重復(fù)測(cè)定同一對(duì)照品溶液6次，峰面積RSD為0.3%，表明有儀器有良好的精密度。

2.2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 重復(fù)測(cè)定同一批甜地丁飲片6次，槲皮素含量 RSD為0.6%，表明重復(fù)性好。

2.2.4 回收率試驗(yàn) 槲皮素平均回收率為96.1%，RSD為0.7%，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)

2.2.5 耐用性

2.2.5.1 供試品溶液的穩(wěn)定性 同一供試品溶液，于制備后 0、1、2、4、8、16、24、48 h 測(cè)定結(jié)果 RSD 為0.4%，表明樣品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5.2 色譜條件的微小變動(dòng) 動(dòng)相組成的微小波動(dòng)：甲醇-0.3%磷酸溶液（48 ∶52）和（52 ∶48）；柱溫的微小變動(dòng)（22、28℃）；流速的微小變動(dòng)（0.9、1.1 mL／min）；檢測(cè)波長(zhǎng)的微小變動(dòng)（358、362 nm）以及采用不同廠家的同類型色譜柱對(duì)供試品溶液槲皮素的分離效果無明顯影響。

2.2.5.3 供試品溶液制備條件的微小變動(dòng) 加熱回流時(shí)間的微小變動(dòng)（110、130 min），水解時(shí)間的微小變動(dòng)（25、30 min），同批甜地丁飲片槲皮素含量結(jié)果相對(duì)相差在1.5%以內(nèi)。

表2 10批樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論與小結(jié)

本研究中采用3個(gè)廠家生產(chǎn)的硅膠G薄層板對(duì)薄層鑒別效果進(jìn)行了比較，結(jié)果表明槲皮素均分離良好。但槲皮素專屬性較差，含有槲皮素的藥材種類較多，如能加快甜地丁對(duì)照藥材的研制，采用對(duì)照藥材進(jìn)行鑒別則能更好的控制藥材質(zhì)量。

本研究中供試品溶液制備項(xiàng)對(duì)甜地丁飲片的回流時(shí)間進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)回流時(shí)間為1 h，所測(cè)槲皮素含量值偏低，而回流時(shí)間為2 h和3 h則無明顯差異，故回流時(shí)間定為2 h。同時(shí)對(duì)精密加入25%鹽酸7 mL，置85℃ 水浴中水解的時(shí)間進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)水解時(shí)間為10 min，所測(cè)槲皮素含量值偏低，而水解時(shí)間為30 min和60 min則無明顯差異，故水解時(shí)間定為30 min。

目前尚無甜地丁中槲皮素含量測(cè)定的報(bào)道。本研究中所用的甜地丁飲片大多購(gòu)自藥店，少量為大學(xué)學(xué)院提供，飲片受炮制加工、存儲(chǔ)等因素影響較大，要制訂含量限度尚需進(jìn)行大量研究。

［1］中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典二○一○年版二部［S］.

［2］王曉飛，于 玲，杜華霜，等.三白草中槲皮素的薄層色譜鑒別［J］.中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2013，23（1）： 65-68.

［3］王 信.HPLC法測(cè)定虎杖葉中槲皮素的含量［J］.中藥材，2006，04（1）： 96-97.

［4］王祥培，許士娜，吳紅梅，等.天胡荽藥材中槲皮素的薄層鑒別與含量測(cè)定［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（1）： 44-45.

［5］高迎春，楊修鎮(zhèn)，魏秀麗，等.地錦草提取物制備工藝及質(zhì)量控制研究［J］.中國(guó)獸藥雜志，2010，44（6）： 23-26.