閆志強 ，朱兆榮 ，劉 娟 ，劉俊瑋

（西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物醫(yī)學(xué)系，重慶 榮 昌 402460）

抵抗感染是免疫的重要功能之一，當動物的免疫功能正常時，就可以通過特異或非特異免疫來消滅侵入機體呼吸道，消化道等的病原微生物，而免疫低下時就會引起機體感染病原微生物從而發(fā)病。

苦芩是根據(jù)中獸醫(yī)理論和臨床辯證論治的原則，選用由苦參、黃芩、黃芪、金銀花、白頭翁、梔子組成的中藥復(fù)方。前期研究表明，苦芩對動物機體免疫功能有一定的增強作用[1-4]，但其可能的作用機理尚不清楚，本試驗通過分離提取苦芩中主要活性成分總多糖，并作用于免疫低下小鼠，通過測定與免疫功能相關(guān)的指標，以進一步探索苦芩總多糖對小鼠免疫功能的影響，為臨床使用苦芩治療免疫方面疾病提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 昆明系小鼠，體重20±2 g，健康無病，雌雄各半，購自西南大學(xué)榮昌校區(qū)實驗動物中心；苦參、黃芩、黃芪、金銀花、白頭翁、梔子，購自桐君閣中藥批發(fā)市場；豚鼠血清補體，購自廣州蕊特生物科技有限公司，批號∶111022；環(huán)磷酰胺，購自山西普德藥業(yè)有限公司，批號∶20120304；黃芪多糖注射液，購自四川廣漢市本草植化有限公司，批號∶20120318；RPMI-1640培養(yǎng)基，購自Gibco公司，批號∶8111185；苦芩和苦芩總多糖均由西南大學(xué)榮昌校區(qū)中藥創(chuàng)新實驗室提供，其藥物濃度均為1 mL中含生藥40 mg；MTT，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，批號∶LJ0901B8011Z；脂多糖，購自Sigma公司，批號∶2070B67；刀豆蛋白A，購自北京邦定泰克生物技術(shù)公司，批號∶20100413；其他試劑均為分析純。

1.2 試驗分組處理及模型的建立 將小鼠隨機分為空白組、模型組、陽性藥物組、苦芩組（20 mg/kg體重）、總多糖高劑量組（40 mg/kg體重）、總多糖中劑量組（20 mg/kg體重）、總多糖低劑量組（10 mg/kg體重），每組小鼠10只。按體重灌胃給藥14 d，1次/d。在首次給藥后，除空白組外，其余各組腹腔注射環(huán)磷酰胺0.2 mL（80 mg/kg體重），建立免疫低下模型，1次/d，連續(xù)5 d?？瞻捉M與模型組給予等量生理鹽水，陽性藥物組灌胃黃芪多糖（30 mg/kg體重）。

1.3 碳粒廓清指數(shù)測定[5]各組小鼠末次給藥1 h后，以0.1 mL/10 g體重的劑量，尾靜脈注射處理后的印度墨汁，注射后2、10 min從小鼠眼眶后靜脈取血20 μL，立即加到2 mL 0.1%Na2CO3溶液中，取正常小鼠血液0.1%的Na2CO3溶液較零，于650 nm測光密度值（OD1和OD2），計算碳粒廓清指數(shù)（K）和吞噬指數(shù)（α）。

K=（lgOD1-lgOD2）/（t2-t1）；α=K1/3×體質(zhì)量/（肝質(zhì)量+脾質(zhì)量）。其中，OD1、OD2分別代表先后2次所采血樣測得的光密度值，t2-t1代表2次采血的時間間隔。

1.4 免疫器官指數(shù)的測定 將小鼠處死后，稱小鼠體質(zhì)量，取脾臟和胸腺，稱其鮮重，按公式計算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量；胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.5 血清溶血素的測定（凝集法）[6-7]給藥第7天各組小鼠腹腔注射5%CRBC懸液0.2 mL，免疫7 d，在末次給藥24 h后，取血，室溫放置1 h，2 000 r/min離心10 min。離心后血清用生理鹽水稀釋100倍。取稀釋后血清1 mL與5%CRBC懸液0.5 mL、10%補體0.5 mL，混勻，在37℃恒溫箱中30 min后于0℃冰箱終止反應(yīng)。2 000 r/min離心10 min后取上清液于紫外分光光度計540 nm處測光密度值OD，溶血素值以半數(shù)溶血值HC50表示。HC50=（樣品光密度值/CRBC半數(shù)溶血時光密度值）*稀釋倍數(shù)。

1.6 T、B淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗測定（MTT法）[7-8]在無菌條件下取脾，研磨成漿液，用含10%新生牛血清及2%慶大霉素的RPMI-1640全培養(yǎng)液重懸細胞，調(diào)整脾細胞濃度為3×106個/mL，取96孔細胞培養(yǎng)板，每孔加制備成脾細胞懸液200 μL，刀豆蛋白A 15 μL（終濃度為6 mg/L），8復(fù)孔，于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。結(jié)束前4 h棄上清，加人MTT液20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μL終止反應(yīng)，將96孔板移入平板震蕩器，混勻，使MTT還原產(chǎn)物完全溶解，在630 nm波長處測定每孔光密度值（OD值）；以同樣的方法，把刀豆蛋白換成脂多糖，測定B淋巴細胞轉(zhuǎn)化情況。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法 用SPSS統(tǒng)計軟件，對所有數(shù)據(jù)進行顯著性檢驗，并進行分析比較，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果

2.1 苦芩總多糖對小鼠吞噬指數(shù)α的影響 試驗結(jié)果顯示，模型組小鼠吞噬指數(shù)α下降，與空白組相比，差異極顯著（P＜0.01）；苦芩組、總多糖高、中劑量組小鼠吞噬指數(shù)α升高，與模型組相比，差異極顯著（P＜0.01），總多糖低劑量組小鼠碳粒吞噬指數(shù)α升高，差異顯著（P＜0.05），各組間存在一定的量效關(guān)系，詳見表1。

表1 苦芩總多糖對免疫低下小鼠吞噬指數(shù)α影響 （X±S）

2.2 苦芩總多糖對免疫低下免疫器官指數(shù)的影響 試驗結(jié)果顯示，模型組小鼠免疫器官指數(shù)降低，與空白組相比，差異極顯著（P＜0.01）；苦芩組小鼠胸腺指數(shù)升高，與模型組相比，差異極顯著（P＜0.01），脾臟指數(shù)升高，差異顯著（P＜0.05）；總多糖組小鼠胸腺指數(shù)均升高，其中高、中劑量組小鼠胸腺指數(shù)與模型組相比，差異極顯著（P＜0.01），低劑量組差異顯著（P＜0.05）；總多糖組小鼠脾臟指數(shù)升高，其中高劑量組小鼠胸腺指數(shù)，與模型組相比，差異極顯著（P＜0.01），中劑量組有顯著性差異（P＜0.05），低劑量組差異不顯著，各組間存在一定的量效關(guān)系，見表2。

2.3 苦芩總多糖對免疫低下小鼠血清溶血素的影響 試驗結(jié)果表明，模型組小鼠血清HC50降低，與空白組相比，有極顯著差異（P＜0.01），苦芩組、總多糖高劑量組小鼠血清HC50升高，與模型組相比，差異極顯著（P＜0.01）；中劑量組小鼠血清HC50升高，與模型組相比，差異顯著（P＜0.05），低劑量組差異不顯著，各組間存在一定的量效關(guān)系，見表3。

表2 苦芩總多糖對免疫低下小鼠免疫器官指數(shù)影響 （X±S）

表3 苦芩總多糖對免疫低下小鼠血清溶血素影響 （X±S）

2.4 苦芩總多糖對小鼠T、B淋巴細胞增殖的影響 試驗結(jié)果顯示，模型組小鼠T、B淋巴細胞轉(zhuǎn)化率降低，與空白對照組比，差異顯著（P＜0.05）；苦芩組能明顯增加T、B淋巴細胞的轉(zhuǎn)化率，特別是對B淋巴細胞的轉(zhuǎn)化率，與模型組比，差異極顯著（P＜0.01）；與模型組相比，總多糖組能明顯增加T、B淋巴細胞的轉(zhuǎn)化率，詳見表4。

表4 苦芩總多糖對小鼠T、B淋巴細胞增殖的影響 （X±S）

3 分析與討論

巨噬細胞的吞噬、殺傷、抗原加工和呈遞、合成和分泌各種活性因子的功能使得巨噬細胞在免疫方面有著相當重要的作用。另外巨噬細胞還是機體非特異性免疫的標志物之一。碳粒廓清指數(shù)可以很好的反映機體巨噬細胞的吞噬功能。本試驗中苦芩總多糖對免疫抑制小鼠碳粒廓清水平有增強作用，且隨劑量增加，增強作用越明顯。表明苦芩及其總多糖均對小鼠的吞噬細胞功能有促進作用。

胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)是評價機體免疫功能狀況的重要指標之一，通過免疫器官指數(shù)可以間接了解體內(nèi)淋巴細胞總體水平[9-10]。淋巴細胞轉(zhuǎn)化率是評價細胞免疫功能的一個重要指標[11]。因此免疫器官指數(shù)和T、B淋巴細胞轉(zhuǎn)化率都可以直接或者間接來反映機體的體液免疫和細胞免疫狀態(tài)。本試驗中苦芩及其總多糖可以提高小鼠脾臟、胸腺指數(shù)，并且T、B淋巴細胞的轉(zhuǎn)化率明顯升高。

血清溶血素的測定可以反映機體的體液免疫狀態(tài)，用藥后溶血素生成增多，表明機體體液免疫功能增強[12]。本試驗中，苦芩及其總多糖均能增強小鼠血清溶血水平，但其中總多糖低劑量對免疫抑制小鼠溶血水平影響無明顯差異，提示苦芩及其總多糖在一定的劑量水平上可增強小鼠血清溶血素。

綜上所述，苦芩及其總多糖可以提高吞噬細胞吞噬功能，增強體液免疫和細胞免疫，通過調(diào)節(jié)機體的免疫系統(tǒng)從而增強機體的免疫功能。

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