貢 嘎，王 剛，拉 珍，邢東義，索朗斯珠

（西藏大學農(nóng)牧學院動物科學學院，西藏 林芝 860000）

大腸桿菌是人和動物的腸道共棲菌和條件性致病菌。由于畜禽養(yǎng)殖期間大量、廣泛使用抗菌藥物，造成動物源大腸桿菌耐藥株不斷增多，耐藥機制日趨復雜[1]，給動物疾病防治帶來嚴峻挑戰(zhàn)；目前，細菌對常用抗生素產(chǎn)生耐藥性已經(jīng)引起普遍的關(guān)注，其中大腸桿菌的耐藥性研究較為集中也較為深入[2]。大腸桿菌耐藥株引起的感染在臨床上不但有增多趨勢，而且其耐藥性亦不斷發(fā)生變遷[3]。而區(qū)牦牛大腸桿菌耐藥性的研究報道較少，本文從本區(qū)不同地區(qū)分離鑒定牦牛大腸桿菌，并對牦牛大腸桿菌耐藥性進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料 在拉薩當雄、林芝、日喀則、阿里、那曲、昌都等地采集腹瀉牦牛新鮮無污染糞便，裝入自封袋，編號，待檢。

1.2 主要試劑 （1）普通瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、伊紅美藍平板、生化培養(yǎng)基均由本實驗室制備[4]；（2）藥敏紙片：共15種，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 細菌的分離與鑒定

1.3.1 分離培養(yǎng) 無菌取出待檢糞樣，接種在普通平板上，在37℃培養(yǎng)24 h，觀察生長情況，并進行革蘭染色鏡檢。

1.3.2 鑒定 挑取普通平板上典型菌落分別接種在麥康凱瓊脂平板及伊紅美藍平板上劃線，37℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。同時挑取典型菌落分別接種到生化培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，每天觀察結(jié)果。

1.4 藥敏試驗 無菌操作選取分離細菌純培養(yǎng)物致密劃線于普通營養(yǎng)瓊脂平板上，將臨床常用的15種抗生素藥敏紙片貼于瓊脂平板表面中央處，倒置平皿，放于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。

1.5 抑菌結(jié)果的判定 參照NCCLS（2013）公布的標準以敏感（Susceptible）、中介（Intermediate）、耐藥（Resistant）3種形式對抑菌圈大小作出判定，個別抑菌圈大小參考相關(guān)文獻作出判定，具體判定標準見表1。

表1 藥敏試驗判定標準

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌分離鑒定

2.1.1 在普通平板上生長出圓形、光滑、濕潤、半透明、灰白色菌落。經(jīng)革蘭染色后發(fā)現(xiàn)革蘭陰性兩端鈍圓的直桿菌。

2.1.2 在麥康凱瓊脂平板及伊紅美藍平板上分別形成紅色菌落和帶金屬閃光的菌落。并能發(fā)酵乳糖、葡萄糖、蔗糖，其中乳糖發(fā)酵最快。甘露醇、吲哚、甲基紅均陽性，V-P、枸櫞酸、氧化酶呈陰性。

2.2 大腸桿菌體外藥敏試驗結(jié)果 藥敏試驗選用分屬6類抗菌藥物的15種抗菌藥物，其中β-內(nèi)酰胺類3種，氨基糖苷類5種，四環(huán)素類2種，喹諾酮類3種，酰胺醇類1種，其他1種。藥敏試驗表明，西藏牦牛耐藥大腸桿菌對同類藥物之間存在交又耐藥性。見表1。

2.3 牦牛耐藥大腸桿菌的耐藥率

2.3.1 西藏牦牛大腸桿菌的耐藥情況 來自西藏拉薩當雄、林芝、日喀則、阿里、那曲、昌都等地11個牦牛耐藥大腸桿菌對15種抗菌藥物有不同程度耐藥性。見表2，圖1。

表2 藥物敏感試驗結(jié)果

2.3.2 11株耐藥菌株的耐藥譜 11株牦牛耐藥大腸桿菌對15種抗菌藥物有不同程度的耐藥性，且多重耐藥現(xiàn)象較重（表3），最少為7種，最多為12種。8耐和11耐菌株所占總菌株比例最大為27.27%；其次是 9耐為18.18%；7耐、10耐、12耐菌株均占總菌株的9.09%。見圖2。

表3 牛源耐藥大腸桿菌的多重耐藥率

3 討論

3.1 牦牛大腸桿菌的耐藥現(xiàn)狀及分析 已有研究表明,我國多重耐藥現(xiàn)象普遍嚴重[5]。本試驗結(jié)果表明，西藏牦牛腸道大腸桿菌對抗菌藥物的耐藥率極高，作者認為，由于西藏老百姓文化水平較低，目前對細菌耐藥性的認識不夠清楚，因此在食品動物養(yǎng)殖中普遍存在濫用抗生素以及嚴重缺乏聯(lián)合、交叉、輪換等用藥方式來減少細菌的耐藥率的意識。因此西藏牦牛大腸桿菌耐藥水平較高、耐藥譜較廣，多重耐藥現(xiàn)象較重。

大腸桿菌作為腸道菌，在條件變差及其他病原感染后易繼發(fā)致病。并且其血清型眾多，抗原復雜，變異大，菌株易產(chǎn)生廣泛的耐藥性和多重耐藥性，在實際生產(chǎn)中疫苗預防和藥物防治效果不理想。本試驗采用WHO推薦的K-B紙片法檢測11株大腸桿菌對15種抗菌藥物的敏感性。其中對頭孢唑啉、氨芐西林、多西環(huán)素、頭孢氨芐、呋喃妥因、新霉素的耐藥率較高，其中對頭孢唑啉耐藥率為100%，對后5種藥的耐藥率也高達90.9%，對四環(huán)素和鏈霉素的耐藥率達81.8%，對阿米卡星、阿莫西林和慶大霉素的耐藥率分別為72.7%和63.4%、對卡那霉素耐藥程度較低，達36.3%。；但耐藥菌株對氧氟沙星、氟羅沙星、諾氟沙星等藥物的敏感性較高，達90.9%～100%。

試驗結(jié)果表明，獸醫(yī)臨床用藥應根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，有針對性地使用，而且必須經(jīng)常更換抗菌藥種類，以免產(chǎn)生新的耐藥菌株，同時較好地控制畜禽大腸桿菌病，只有這樣才能有針對性的選用敏感藥物。另一方面，盡量在飼料中少用抗菌藥，治療用藥必須合理，有針對性，在食品動物養(yǎng)殖中少并再不可濫用抗菌藥，還應考慮采取聯(lián)合用藥、交叉或輪換用藥等方法[7]。

試驗結(jié)果表明，本次從西藏牦牛體內(nèi)分離的大腸桿菌對頭孢唑啉、氨芐西林、多西環(huán)素、頭孢氨芐、呋喃妥因、新霉素的耐藥率較高，表明只有少數(shù)藥物對多數(shù)分離菌株有效，多數(shù)藥物的效力不理想，大量耐藥菌株的產(chǎn)生，已給當?shù)仞B(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。所以對病原菌進行耐藥性檢測勢在必行。因此建議在獸醫(yī)臨床上應選停用耐藥性極強的藥物，應選擇敏感性較高的藥物來針對性治療牦牛大腸桿菌病。

3.2 控制牦牛大腸桿菌耐藥性的對策 （1）大力宣傳細菌耐藥性等相關(guān)專業(yè)知識，提高老百姓對細菌耐藥性的意識，做到家喻戶曉，人人皆知；（2）實行管理部門與獸醫(yī)人員的指導下計劃性輪換、交叉或聯(lián)合用藥；（3）使用抗生素的同時，開發(fā)及利用傳統(tǒng)藏獸藥對降低細菌耐藥可能具有重要的意義；（4）治療用藥應根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，用藥必須合理、有針對性；而且必須經(jīng)常更換抗菌藥種類，以免產(chǎn)生新的耐藥菌株；（5）應以免疫預防為主，執(zhí)行嚴格的消毒隔離制度，同時動物加強飼養(yǎng)管理。

[1]馬紅霞，劉玉堂，傘治豪.不同動物源性大腸桿菌多重耐藥調(diào)控基因rob的同源性分析[J].中國獸醫(yī)科學，2007，37（12）:1035-1040.

[2]俞道進，黃一帆，鄧文華，等.豬場大腸桿菌耐藥性的流行病學調(diào)查[J].福建農(nóng)林大學學報（自然科學版），2005，34（9）：357-360.

[3]Murray B E.New aspects of antimicrobial resistance and resulting the therapeutic dilemmas[J].J Infect Dis，1991，163:1185.

[4]姚火春.獸醫(yī)微生物學實驗指導[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2011：36-42.

[5]呂殿紅，曾振靈，陳杖榴，等.大腸埃希菌多重耐藥性的形成機制[J].動物醫(yī)學進展，2007，28（7）:76-81.