嚴 麗 李 莉 郝 芳 申 偉 張霖雷 郭 浩

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院腺體外科，石家莊 050000)

乳腺癌的發(fā)病率已位居女性惡性腫瘤的首位，且呈年輕化的趨勢，有關(guān)乳腺癌發(fā)病機制及治療方面的實驗研究越來越多，而在實驗中最為重要的就是乳腺癌動物模型的制備。目前報道多為人乳腺癌細胞的裸鼠異種移植模型，而小鼠乳腺癌細胞移植模型的報道較少。4T1細胞是建立BALB/c小鼠乳腺癌模型較常用的一種細胞株，但在模型制備中所采用的細胞用量往往不統(tǒng)一，用量小造成制模時間延長或制模失敗;用量大造成細胞浪費，增加實驗成本。本實驗采用三種常用劑量、兩種不同接種部位進行比較，希望選擇一種理想的模型制備方法。

1 材料與方法

1.1 材料 健康BALB/c小鼠90只(購自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)實驗動物研究所)，雌性，4～6周齡，體重18～20 g，飼養(yǎng)于河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF級實驗室，隨機分為3組，每組各30只;4T1乳腺癌細胞株(購自中科院細胞庫);胎牛血清;RPMI1640完全培養(yǎng)基;抗小鼠C-erbB-2抗體等。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和模型制備 將4T1細胞株進行傳代培養(yǎng)擴增，分別制備成 1×106ml－1、1×107ml－1、1×108ml－1的細胞懸液。分別在3組 BALB/c小鼠胸壁5～6肋間和側(cè)腹壁皮下接種相應(yīng)濃度的細胞懸液0.1 ml(3組劑量相當于105/只、106/只和107/只)。

1.2.2 模型評定方法 注射4T1細胞后，每天觀察小鼠生活飲食及接種部位瘤塊的生長情況，包括瘤體出現(xiàn)時間、瘤體大小、成瘤率和8周存活率。第1～8周每隔2 d用游標卡尺測量瘤體的長徑(a)和短徑(b)，并根據(jù)V=ab2/2計算瘤體體積，繪制生長曲線。留取瘤體組織進行HE染色，病理觀察。用抗小鼠C-erbB-2單克隆抗體對瘤體組織進行免疫組化染色，鏡下觀察。

圖1 小鼠乳腺浸潤性導(dǎo)管癌(HE，×400)Fig.1 Mice breast invasive ductal carcinoma(HE，×400)

圖2 乳腺癌組織C-erbB-2陽性表達(×400)Fig.2 Expression of C-erbB-2 in breast tumor tissues( ×400)

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤生長情況和病理學(xué)檢查結(jié)果 接種4T1細胞8～17 d時，接種部位出現(xiàn)瘤結(jié)節(jié)，瘤體增大并與周圍組織黏連。14 d后瘤體生長加快，30 d后部分小鼠成瘤部位皮毛破潰。8周后統(tǒng)一處死小鼠，解剖可見瘤體淡黃粉色，具有完整包膜并與周圍組織黏連，部分伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。瘤體質(zhì)地中等偏硬，多呈圓形或橢圓形分葉狀，組織細胞呈索團狀排列，局部可見壞死灶;鏡檢見癌細胞體積大，胞質(zhì)嗜酸性，核大，核仁清晰，病理診斷為浸潤性導(dǎo)管癌(見圖1)。瘤體組織免疫組織化學(xué)檢測C-erbB-2均呈陽性表達(見圖2)。

表1 不同組別成瘤狀況比較(n=30)Tab.1 Different groups of tumor status(n=30)

表2 不同接種部位成瘤狀況比較(n=45)Tab.2 Different parts of tumor status(n=45)

圖3 不同接種濃度下瘤體生長曲線(瘤體體積數(shù)值為平方根值)Fig.3 Growth curve of tumor inoculation concentration(Tumor volume number is expressed as square root of itself)

2.2 成瘤時間、成瘤率及荷瘤小鼠存活時間 見表1。

2.3 不同接種部位成瘤時間、成瘤率及存活時間見表2。

2.4 移植瘤的生長曲線 見圖3。

3 討論

隨著乳腺癌發(fā)病率的逐年升高及年輕化趨勢的加強，人們對乳腺癌發(fā)病機制及治療的研究越來越深入，也越來越成為熱點。而乳腺癌動物模型的制備，在這一過程中起著非常關(guān)鍵的作用。根據(jù)制備方法和研究目的的不同，乳腺癌實驗動物模型可分為移植性、誘發(fā)性、自發(fā)性、基因敲除性及乳腺癌遠處轉(zhuǎn)移等5大類。移植性模型是將乳腺癌細胞或組織種植于實驗動物胸部或腹部而培養(yǎng)出的模型。此種模型因其生長速度快、成瘤率高、易飼養(yǎng)等優(yōu)點，已成為臨床應(yīng)用最廣的一種模型。誘發(fā)性模型是利用物理、化學(xué)或生物等因素在實驗動物體內(nèi)誘發(fā)腫瘤。該模型多用于病因?qū)W及預(yù)防性研究，缺點是個體差異大和建模時間長。自發(fā)性模型是實驗動物種群中自然發(fā)生或通過遺傳育種培養(yǎng)而形成的一類腫瘤。從腫瘤發(fā)生來看與人類腫瘤相似，有利于發(fā)病機制的研究;但是，該模型實驗時間長，花費大。基因敲除性模型多用于腫瘤發(fā)生發(fā)展中基因生物學(xué)功能的研究。遠處轉(zhuǎn)移模型多用于藥物開發(fā)［1-4］。

目前，乳腺癌動物模型中所選用的動物多為小鼠、裸鼠、大鼠、貓等，其中小鼠和裸鼠因誘癌周期短多被選用。但裸鼠飼養(yǎng)成本較高且免疫功能缺陷不適于臨床治療方面的研究。本實驗是針對免疫功能正常的小鼠乳腺癌移植模型的制備，采用的近交系BALB/c小鼠，來源于BALB/c小鼠的乳腺癌細胞株文獻報道比較多的是4T1和TM40D兩種細胞株。本實驗選取4T1細胞株移植于BALB/c小鼠建立乳腺癌模型，這種模型是目前臨床藥物篩選使用最多的一種乳腺癌模型［5-8］。目前，很多文獻報道的4T1細胞用量存在很大的差異，本實驗選取了1×106ml－1、1×107ml－1、1×108ml－1三種常用劑量，同時又分別選取了胸壁5～6肋間和側(cè)腹壁兩個常用注射部位進行比較，發(fā)現(xiàn)兩種不同注射部位種植成活率和腫瘤生長情況之間無差別(P＞0.05)。1×106ml－1、1×107ml－1、1×108ml－1三種常用劑量的種植成活率無統(tǒng)計學(xué)意義。但是，1×106ml－1時腫瘤的成瘤時間延遲，種植后16 d左右于接種部位觸及直徑約2 mm結(jié)節(jié)，以后迅速增大，于第24天左右直徑約10 mm;第30天腫瘤長徑約20 mm;其后增長緩慢。1×107ml－1時腫瘤成瘤時間相對早，于種植后10 d左右于接種部位觸及直徑約2 mm結(jié)節(jié)，18 d左右直徑約10 mm，26 d腫瘤長徑約18 mm，其后增長緩慢。1×108ml－1時腫瘤成瘤時間與1×108ml－1時相似，但是腫瘤生長更為迅速。對于臨床用藥觀察來說，1×107ml－1的用量更為經(jīng)濟合理，更易于用藥周期的安排，是最理想的模型制作方法。

［1］仲 雷，張建國.乳腺癌實驗動物模型的研究進展［J］.中國普通外科雜志，2008，17(5):484-487

［2］Xia TS，Wang GZ，Ding Q，et al.Bone metastasis in a novel breast cancer mouse model containing human breast and human bone［J］.Breast Cancer Res Treat，2012，132(2):471-486.

［3］Wang J，Xia TS，Liu XA，et al.A novel orthotopic and metastatic mouse model of breast cancer in human mammary microenvironment［J］.Breast Cancer Res Treat，2010，120(2):337-344.

［4］Xia TS，Wang J，Yin H，et al.Human tissue-specific microenviro nment:an essential requirement for mouse models of breast cancer［J］.Oncol Rep，2010，24(1):203-211.

［5］徐 林，蔣正剛，李寶華，等.小鼠乳腺癌實驗動物模型中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的變化及意義［J］.復(fù)旦學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2006，33(6):736-740.

［6］Liao D，Luo Y，Markowitz D，et al.Cancer associated fibroblasts promote tumer growth and metastasis by modulating the tumor immune microenvironment in a 4T1 murine breast cancer model［J］.PLoS One，2009，4(11):e7965.

［7］Tao K，F(xiàn)ang M，Alroy J，et al.Imagable 4T1 model for the study of late stage breast cancer［J］.BMC Cancer，2008，8(228):1-20.

［8］孫金中，孫圣榮，金化民，等.三種建立小鼠乳腺癌移植模型方法的比較 .［J］.武漢大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2006，27(3):335-337.