張秀麗，王宇紅*，楊 蕙，徐雅蘭

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙410208；2.湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，湖南 長(zhǎng)沙410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥藥理（心血管）實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙410007）

糖尿病是一種常見(jiàn)的慢性疾病， 我國(guó)約有1.43 億人患有糖尿病， 糖尿病患者易并發(fā)抑郁癥， 其患抑郁癥的可能性是普通人的3～5 倍，復(fù)發(fā)率是非糖尿病患者的8 倍[1]。 而糖尿病并發(fā)抑郁癥（Diabetes mellitus with depression，DD）患者的自殺危險(xiǎn)性高達(dá)10%[2]，遠(yuǎn)高于普通抑郁癥患者。 目前尚無(wú)一種模型能夠完全模擬人類DD 的臨床癥狀與體征，極大限制了DD 發(fā)病機(jī)制和藥物研究。本課題組在前期研究過(guò)程中， 基于臨床病人發(fā)病特征，采用復(fù)合式高脂灌胃、 鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）注射和慢性應(yīng)激“三聯(lián)法”，建立了一種簡(jiǎn)便、可靠、穩(wěn)定而又有與人類DD 相似癥狀的動(dòng)物模型[3]。 但是，僅有動(dòng)物模型，很難全面闡釋某一疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。 DD 發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵靶器官是海馬組織中的海馬神經(jīng)元細(xì)胞，該細(xì)胞的損傷都是微觀的，在體實(shí)驗(yàn)中很難觀察，只有進(jìn)一步通過(guò)建立DD細(xì)胞模型， 才能全面闡明DD 損傷海馬神經(jīng)元細(xì)胞的機(jī)制。 但國(guó)內(nèi)外僅有糖尿病細(xì)胞模型以及抑郁癥細(xì)胞模型，DD 的細(xì)胞模型尚未見(jiàn)報(bào)道。 李靜等[4]采用CORT（100 μM/L）損傷原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞，模擬應(yīng)激狀態(tài)下高濃度糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷。 與我們前期經(jīng)CORT 誘導(dǎo)建立抑郁癥細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。 因此我們利用高糖（75 mM/L）聯(lián)合CORT（100 μM/L）誘導(dǎo)原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞建立DD 細(xì)胞模型。 左歸降糖解郁方是針對(duì)DD 中醫(yī)“虛、瘀、郁”基本病機(jī)的有效方藥，近年來(lái)本課題組對(duì)左歸降糖解郁方對(duì)DD 的干預(yù)進(jìn)行了較深入的研究，如細(xì)胞模型復(fù)制及中藥干預(yù)[3，5-6]。 本實(shí)驗(yàn)采用復(fù)方中藥左歸降糖解郁方對(duì)DD 細(xì)胞模型進(jìn)行干預(yù)，探討中醫(yī)藥治療DD 療效，為其提供新思路，現(xiàn)將方法與結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)SD 懷孕大鼠（受孕19 d）1 只與SPF 級(jí)SD 大鼠（體質(zhì)量約200～220 g）30 只購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司， 許可證號(hào)：SCXK (湘)2011-0003。

1.2 藥物

左歸降糖解郁方：黃芪18 g，熟地黃15 g，枸杞12 g，山茱萸12 g，丹參12 g，姜黃9 g，菟絲子9 g，杜仲9 g，牛膝9 g，牡丹皮6 g，貫葉連翹3 g。原材料購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，并由該院制劑科按比例水煎濃縮后制成口服液100 mL，采用一測(cè)多評(píng)的質(zhì)量控制方法，其含主要藥效成分分別為黃芪甲苷≥30 μg/mL、 貫葉金絲桃素≥18 μg/mL、 姜 黃 素≥0.4 mg/mL、 丹 酚 酸B ≥1.2 mg/mL、 丹皮酚≥0.2 mg/mL； 鹽酸二甲雙胍片（規(guī)格0.25 g/片，批號(hào)1303106，湖南湘雅制藥有限公司）； 鹽酸氟西汀膠囊 （規(guī)格20 mg/粒， 批號(hào)0972A，法國(guó)Patheon France）。

1.3 主要試劑

皮質(zhì)酮、L-多聚左旋賴氨酸、 二甲亞砜(Sigma，美國(guó))；胰蛋白酶、噻唑藍(lán)(MTT) (AMRESCO，美國(guó))；膠原酶、D-葡萄糖、DMEM/F12、B27 添加劑、Neurolbasal、胎牛血清（Gibco，美國(guó)）；NMDAR2A 一抗、二抗（Ambo 試劑公司分裝）；羊抗兔IgG(二抗)（PROTEINIECH， 美國(guó)）；TUNEL 試劑盒 （Boehringer，德國(guó)）；DAB 顯色試劑盒、SABC 免疫組化試劑盒 （武漢博士德生物工程有限公司）；Penicillin、Streptomycin（碧云天生物技術(shù)研究所）；葡萄糖氧化酶-過(guò)氧化物酶（GOD-POD）試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司）；NSE 免疫組化試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。

1.4 主要儀器

DMIRB 倒置熒光顯微鏡(Leica)；TECAN 酶標(biāo)定量測(cè)試儀 (瑞士Bio-Rad)；3110 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific Forma)；BIX-103G 解 剖 顯 微 鏡(北京陸?？萍加邢薰?；JA1003N 電子天平(天津精密科學(xué)儀器有限公司)。

2 方法

2.1 含藥血漿的制備

將SPF 級(jí)SD 大鼠30 只分為空白組、二甲雙胍合氟西汀組及左歸降糖解郁方組 （每組10 只）用于制備含藥血漿。 給藥劑量按前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果[5]，即二甲雙胍按0.18 g/kg、氟西汀按1.8 mg/kg、左歸降糖解郁方按20.53 g/kg 給藥，1 天2 次，連續(xù)3 d，末次給藥1 h 后處死動(dòng)物取含藥血漿。 空白組給予相同劑量的蒸餾水后取血漿作為空白血漿。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將受孕19 d 的SD 大鼠處死后，取出8 只胎鼠的海馬組織迅速投入盛有無(wú)菌PBS 緩沖液 （1 ℃）的培養(yǎng)皿中，加入與無(wú)菌PBS 等體積的0.25%胰蛋白酶和0.2%膠原酶， 輕輕吹打30～50 次，37 ℃消化，每隔3～5 min 手動(dòng)輕輕混勻1 次，消化至無(wú)明顯組織沉淀后加入培養(yǎng)液終止消化，混勻，100 目篩網(wǎng)過(guò)濾，1 000 r/min 離心5 min 收集細(xì)胞。 調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/mL，按100 μL/孔接種至96 孔板，分4 組（即空白組、模型組、二甲雙胍合氟西汀組及左歸降糖解郁方組）， 每組4個(gè)復(fù)孔，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 以后每隔3 d 換1 次維持培養(yǎng)液。海馬神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)約7 d， 至觀察到由增大的神經(jīng)元胞體、明顯的光暈、延長(zhǎng)的突起形成較為復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)[3]。

2.3 細(xì)胞模型建立

將“2.1”接種的模型組與給藥組細(xì)胞加入高糖(75 mM) 聯(lián)合100 μM 皮質(zhì)酮建立DD 細(xì)胞模型[4]，空白組加入葡萄糖濃度至25 mM。

2.4 給藥方法及給藥劑量

于“2.2”各組細(xì)胞中加入空白血漿及含藥血漿，體積為25 μL/孔。

2.5 指標(biāo)檢測(cè)

2.5.1 海馬神經(jīng)元細(xì)胞一般形態(tài)學(xué)觀察 分別于接種后第6 h、24 h、3 d、7 d 用倒置顯微鏡對(duì)海馬神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行一般形態(tài)學(xué)觀察，并拍照。

2.5.2 神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）法鑒定神經(jīng)細(xì)胞純度 培養(yǎng)7 d 的大鼠海馬神經(jīng)元利用NSE 免疫細(xì)胞化學(xué)染色試劑盒進(jìn)行純度鑒定，海馬神經(jīng)元經(jīng)染色呈彌漫性胞漿著色者為陽(yáng)性細(xì)胞[5]，隨機(jī)選取視野中200個(gè)細(xì)胞統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞比率。

2.5.3 MTT 法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞活性 “2.2”項(xiàng)下各組細(xì)胞經(jīng)“2.3”、“2.4”處理后，每孔加入20 μL MTT溶液，分別于6、12、24、48 h 及72 h 運(yùn)用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)490 nm 測(cè)定各孔的OD 值。 細(xì)胞活性計(jì)算方法如下：

細(xì)胞存活率（%）=OD490(實(shí)驗(yàn)組)/OD490(對(duì)照組)×100%

2.5.4 HE 染色觀察神經(jīng)細(xì)胞損傷狀況 將分離的海馬神經(jīng)元細(xì)胞均勻接種在放有14 mm 圓形蓋玻片的24 孔板中，培養(yǎng)7 d 后按分組情況參照“2.3”、“2.4” 加入不同誘導(dǎo)物與含藥血漿， 孵育24 h 后，HE 染色觀察各組海馬神經(jīng)元的病理改變。

2.5.5 TUNEL 染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 將分離的海馬神經(jīng)元細(xì)胞按“2.5.4”的方法做前期處理。 待藥物干預(yù)24 h 后，取出培養(yǎng)有細(xì)胞的蓋玻片置于4%的中性甲醛中固定10 min， 用PBS 緩沖液清洗2次，TUNEL 染色試劑盒染色。 光鏡下隨機(jī)取15個(gè)高倍鏡視野觀察。

2.5.6 GOD-POD 法檢測(cè)葡萄糖消耗量 將分離的海馬神經(jīng)細(xì)胞植入96 孔板并參照“2.5.3”的方法進(jìn)行相應(yīng)藥物處理， 分別于孵育2、6、12、18、24 h 后按照各時(shí)間點(diǎn)收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，37 ℃保溫10 min， 用葡萄糖測(cè)定試劑盒在酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)505 nm 檢測(cè)培養(yǎng)液OD 值 （理論計(jì)算公式：C樣本=△A 樣本/△A 校準(zhǔn)×C校準(zhǔn)，其中C校準(zhǔn)=5.55 mM/L）。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)以“±s”表示，兩組間的比較采用t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 海馬神經(jīng)元細(xì)胞一般形態(tài)觀察

顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)， 大部分細(xì)胞在接種6 h 就已貼壁，圓球狀，小且透明，少量細(xì)胞有微小突起；培養(yǎng)24 h 后細(xì)胞完全貼壁， 有明顯光暈， 突起較6 h時(shí)稍有見(jiàn)長(zhǎng)；培養(yǎng)的第3 天，神經(jīng)元突起進(jìn)一步拉長(zhǎng)且數(shù)量明顯增多，交織構(gòu)成較為稀松的網(wǎng)絡(luò)；培養(yǎng)的第7 天，神經(jīng)元胞體繼續(xù)增大，周?chē)鈺烇@著，突起延長(zhǎng)，形成繁雜而緊密的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)。 結(jié)果見(jiàn)封三彩圖圖1 所示。

3.2 NSE 神經(jīng)細(xì)胞鑒定結(jié)果

培養(yǎng)7 d 的大鼠海馬神經(jīng)元胞體及樹(shù)突著色良好， 視野下海馬神經(jīng)元NSE 染色陽(yáng)性的細(xì)胞比率在93%以上，表明分離的海馬神經(jīng)元純度高。 結(jié)果見(jiàn)封三彩圖圖2 所示。

3.3 神經(jīng)細(xì)胞活性MTT 檢測(cè)結(jié)果

與空白組相比，各時(shí)間點(diǎn)模型組、二甲雙胍合氟西汀組及左歸降糖解郁方組海馬神經(jīng)元細(xì)胞存活率均明顯降低，所有時(shí)間點(diǎn)均有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；與模型組相比，左歸降糖解郁方組、二甲雙胍合氟西汀組細(xì)胞存活率在第24、48 h 及72 h 均明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05 或P＜0.01)；與二甲雙胍合氟西汀組相比，左歸降糖解郁方組海馬神經(jīng)元細(xì)胞存活率在6、12、24、48 h時(shí)與其作用相當(dāng)， 但在72 h 時(shí)增加更明顯 (P＜0.05)。 見(jiàn)表1。

表1 MTT 法檢測(cè)各組不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞存活率 （±s，n=5，%）

表1 MTT 法檢測(cè)各組不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞存活率 （±s，n=5，%）

注：與空白組比較**P＜0.01；與模型組比較#P＜0.05，##P＜0.01；與二甲雙胍合氟西汀組比較▲P＜0.05。

組 別空白組模型組二甲雙胍合氟西汀組左歸降糖解郁方組6 h 0.0±0.0 84.1±9.1**81.2±10.3**79.9±0.1**12 h 95.2±6.7 72.1±7.2**84.5±5.4**82.1±6.9**24 h 97.6±1.7 67.4±3.4**82.6±4.1**#80.5±5.6**#48 h 99.1±1.2 42.1±9.3**79.5±7.0**##78.7±4.5**##72 h 98.9±11.1 15.3±4.4**61.3±8.0**##73.2±2.2**##▲各時(shí)間點(diǎn)

3.4 HE 病理染色結(jié)果

鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，空白組海馬神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞核成卵圓形，極少數(shù)成梭形，且細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核界線分明；模型組絕大多數(shù)細(xì)胞核呈梭形，近半數(shù)海馬神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)已融合在一起，界線模糊；其余兩組的損傷程度介于空白組和模型組之間。 結(jié)果見(jiàn)封三彩圖圖3 所示。

3.5 細(xì)胞凋亡情況

空白組TUNEL 染色陽(yáng)性細(xì)胞極為少見(jiàn)， 在所選取的15個(gè)視野中僅見(jiàn)數(shù)個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞； 模型組免疫陽(yáng)性細(xì)胞較多， 每個(gè)高倍鏡視野可見(jiàn)4～5個(gè)；左歸降糖解郁方組和二甲雙胍合氟西汀組免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，每個(gè)高倍鏡視野只見(jiàn)2個(gè)左右陽(yáng)性細(xì)胞，細(xì)胞核深染呈藍(lán)黑色，形態(tài)不規(guī)則，有的呈花瓣?duì)睢?結(jié)果見(jiàn)封三彩圖圖4 所示。

3.6 各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞葡萄糖消耗量比較

與空白組比較，模型組葡萄糖消耗量于各時(shí)間點(diǎn)均有顯著降低（P＜0.01)；與模型組比較，左歸降糖解郁方組和二甲雙胍合氟西汀組葡萄糖濃度降低值升高， 并從12 h 開(kāi)始差異均有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；與二甲雙胍合氟西汀組比較，在24 h時(shí)，左歸降糖解郁方組培養(yǎng)基中葡萄糖濃度降低值稍高于二甲雙胍合氟西汀組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)果見(jiàn)表2。

4 討論

近年來(lái)研究表明，海馬是學(xué)習(xí)、認(rèn)知功能主要控制區(qū)，且參與了許多神經(jīng)系統(tǒng)病變機(jī)制，而DD 的損傷部位主要在海馬[6]，所以利用海馬細(xì)胞建立DD損傷模型，研究損傷機(jī)制并觀察藥物對(duì)海馬神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用具有重要意義。 目前國(guó)內(nèi)外采用高糖誘導(dǎo)糖尿病模型最為廣泛[7]，也有許多學(xué)者[4]采用皮質(zhì)酮損傷原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞，模擬應(yīng)激狀態(tài)下高濃度糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致的海馬損傷來(lái)建立抑郁癥細(xì)胞模型。 故本實(shí)驗(yàn)采用二者聯(lián)合的方法，采用高糖聯(lián)合皮質(zhì)酮誘導(dǎo)建立DD 細(xì)胞模型。

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)基中葡萄糖濃度降低值 （±s，n=5，mmol/L）

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)基中葡萄糖濃度降低值 （±s，n=5，mmol/L）

注：與空白組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較#P＜0.01。

組 別空白組模型組二甲雙胍合氟西汀組左歸降糖解郁方組2 h 0.38±0.03 0.19±0.06**0.23±0.06*0.21±0.08*6 h 0.87±0.03 0.31±0.08**0.53±0.05**0.50±0.04**12 h 1.46±0.03 0.35±0.08**1.09±0.09*#0.95±0.11**#18 h 2.04±0.05 0.47±0.12**1.70±0.10*#1.58±0.10**#24 h 2.74±0.07 0.54±0.08**2.09±0.09#2.50±0.09#各時(shí)間點(diǎn)

本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞存活率明顯降低；海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷顯著；TUNEL 染色陽(yáng)性細(xì)胞即凋亡細(xì)胞增多； 葡萄糖濃度降低值從2 h 開(kāi)始明顯低于空白組(P＜0.01)；該特征既符合糖尿病細(xì)胞模型又與抑郁癥細(xì)胞模型相一致，表明采用高糖聯(lián)合皮質(zhì)酮方法可成功建立DD 細(xì)胞模型。

左歸降糖解郁方以張景岳的左歸飲、左歸丸為基礎(chǔ)方化裁而成，方中熟地黃為君滋養(yǎng)腎陰，山茱萸、枸杞為臣，合君藥以加強(qiáng)滋補(bǔ)腎陰作用，佐以菟絲子、牛膝、杜仲補(bǔ)肝腎，黃芪健脾益氣，丹參、牡丹皮活血散瘀，加入化瘀行氣、疏肝解郁的姜黃、貫葉連翹，功能滋陰益氣，化瘀解郁。 本課題組前期臨床研究表明， 左歸降糖解郁方能明顯緩解DD 患者抑郁狀況以及血糖、血脂、胰島素的升高，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)其能明顯改善DD 大鼠糖脂代謝紊亂、 延緩海馬組織的病理?yè)p傷[3，5-6]。

本研究采用MTT 法檢測(cè)海馬神經(jīng)元活性，結(jié)果顯示左歸降糖解郁方組細(xì)胞存活率在第24 h、48 h及72 h 均明顯高于模型組(P＜0.05 或P＜0.01)，且其在72 h 時(shí)也較二甲雙胍合氟西汀組高(P＜0.05)；HE染色后鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：左歸降糖解郁方組細(xì)胞損傷程度介于空白組和模型組之間。TUNEL 染色發(fā)現(xiàn)左歸降糖解郁方組免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，每個(gè)高倍鏡視野只見(jiàn)2個(gè)左右陽(yáng)性細(xì)胞，且細(xì)胞形態(tài)較模型組好。 以上結(jié)果說(shuō)明，左歸降糖解郁方可有效保護(hù)糖尿病合并抑郁癥細(xì)胞模型中產(chǎn)生的細(xì)胞損傷，可明顯提升細(xì)胞存活率，抑制細(xì)胞凋亡。 GOD-POD法檢測(cè)結(jié)果顯示， 左歸降糖解郁方從12 h 起即可明顯增加海馬神經(jīng)細(xì)胞的葡萄糖消耗量(P＜0.01)。

綜上所述， 左歸降糖解郁方對(duì)DD 模型海馬神經(jīng)細(xì)胞模型具有明顯的保護(hù)作用。 該研究結(jié)果將為左歸降糖解郁方治療糖尿病合并抑郁癥的有效性提供體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)佐證，該研究結(jié)果也將為進(jìn)一步結(jié)合體內(nèi)試驗(yàn)研究左歸降糖解郁方的中藥干預(yù)的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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