劉小瑗，范金茹*，王美香，陳學娟，熊 杜，王建湘

（1.湖南中醫(yī)藥大學研究生教育學院，湖南 長沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙410007）

動脈粥樣硬化（Arteriosclerosis，AS）是冠心病與頸動脈斑塊的共同生理病理基礎，通過頸動脈斑塊的形態(tài)及面積的檢測，可以預測冠脈病變及心血管事件的發(fā)生。本研究通過檢測血小板-白細胞（PLTWBC）相關參數(shù)，探討其在冠心病合并頸動脈斑塊痰瘀互結(jié)氣郁證發(fā)病中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將2013年6月至2014年5月于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科病房、心血管門診就診的冠心病合并頸動脈斑塊患者90 例， 按照中醫(yī)證候診斷標準分別納入痰瘀互結(jié)氣郁證組 （觀察組）60例、非痰瘀互結(jié)氣郁證組（對照組）30 例，體檢科健康成年人30 例納入健康組。 3 組的年齡、性別差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性，見表1。

表1 3 組患者一般資料比較

1.2 西醫(yī)診斷標準

參照《慢性穩(wěn)定性心絞痛診斷與治療指南》[1]及《中華人民共和國衛(wèi)生部行業(yè)標準—冠狀動脈粥樣硬化性心臟病診斷標準》[2]， 加拿大心臟病學會（CCS）心絞痛分級標準[1]，頸動脈內(nèi)中膜厚度（IMT）以最厚頸總動脈IMT 為比較變量，將IMT≥1.2 mm定義為粥樣硬化斑塊形成[3-4]。

1.3 中醫(yī)診斷標準

1.3.1 胸痹心痛合并眩暈診斷標準 參照《實用中醫(yī)心病學》[5]及《中藥新藥臨床研究指導原則》[6]相關標準。

1.3.2 中醫(yī)證候診斷標準 參照 《實用中醫(yī)心病學》[5]及《中藥新藥臨床研究指導原則》[6]，胸痹心痛分為：心血瘀阻型、氣虛血瘀型、氣滯血瘀型、痰阻心脈型、陰寒凝滯型、氣陰兩虛型、心腎陰虛型、陽氣虛衰型。 以上8個證型凡具有胸痛、胸悶主癥之一，其他癥具有2 項及舌脈支持者，即可診斷。 （1）主癥：①胸痛、胸悶—胸部刺痛、脹痛或絞痛，固定不移，入夜更甚，或痛引肩背或臂內(nèi)側(cè)，胸脅脹悶或胸悶如窒而痛； ②頭暈目眩； ③氣滯—胸脅不舒，時輕時重，常隨情志改變，情緒不寧，善太息；④多痰表現(xiàn)：口吐痰涎，咽中痰阻，體胖、肢體困重、體質(zhì)量指數(shù)＞25。 （2）次癥：①口唇紫紺，舌質(zhì)紫暗或見瘀斑瘀點，苔膩或滑，舌下系帶迂、紫暗或有瘀點瘀斑； ②心悸不寧；③活動后氣促；④失眠健忘；⑤脈細澀或滑或弦。 具備主癥①、②、④項及以上，次癥具有⑤項及其他任何兩項以上，可診斷為痰瘀互結(jié)氣郁證。

1.4 納入標準

1.4.1 患者標準 符合中、西醫(yī)診斷標準的穩(wěn)定型心絞痛Ⅲ級合并頸動脈斑塊患者，年齡在40～75 歲之間。

1.4.2 健康人標準 （1）60 歲以上入選者參照中華醫(yī)學會老年醫(yī)學分會2013 提出的《中國健康老年人標準》[7]，60 歲以下入選者參照世界衛(wèi)生組織1989年對健康作出的定義；（2）無已有文獻報道的可對P-選擇素（PS）等指標表達有影響的疾??；（3）年齡40～75歲。

1.5 檢測指標及方法

1.5.1 酶聯(lián)免疫吸附法 所有入選病例，于清晨空腹抽取靜脈血4 mL 于抗凝管中， 以3 000 r/min的速度離心15 min。 取上清液，于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?嚴格按照試劑盒（武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號：201402）說明書要求操作，檢測血漿P 選擇素（PS）、P 選擇素糖蛋白配體-1(PSGL-1)、WBC 分化抗原40(CD40)、WBC 分化抗原40配體(CD40L)水平。

1.5.2 流式細胞術 所有入選病例， 于清晨空腹抽取靜脈血4 mL 于抗凝管中， 分別取兩支空白流式管， 標記為管①及管②， 在兩支流式管中分別加入10 mL 全血。于管①中加入2 μL CD45、4 μL CD40、4 μL CD162 及4 μL CD154； 于管②中加入2 μL CD45、4 μL CD40、4 μL CD62P、4 μL CD41a 及4 μL CD154。 避光孵育20～30 min 后分別在兩管中加入BPS 緩沖液300 μL，上流式細胞儀檢測。所有流式細胞術試劑均采用美國BD 公司生產(chǎn)的試劑。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件分析。 計數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，采用卡方檢驗或秩和檢驗；計量資料進行正態(tài)分布和方差齊性檢驗，以“±s”表示， t檢驗，不滿足正態(tài)性分布及方差齊性者采用非參數(shù)檢驗。 所有數(shù)據(jù)均采用雙側(cè)檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組患者血漿PS、PSGL-1、CD40、CD40L 比較

觀察組、對照組血漿PS、PSGL-1、CD40、CD40L水平均明顯高于健康組（P＜0.01），且觀察組高于對照組（P＜0.01），見表2。

表2 3 組患者血漿PS、PSGL-1、CD40、CD40L 比較 （±s）

表2 3 組患者血漿PS、PSGL-1、CD40、CD40L 比較 （±s）

注：與健康組比較**P＜0.01；與對照組比較##P＜0.01。

組 別觀察組對照組健康組n 60 30 30 PS(ng/L)30.28±6.11**##22.47±7.39**7.83±3.39 PSGL-1(pg/mL) CD40(ng/L) CD40L(ng/L)3 013.54±320.72**## 68.58±6.13**## 713.71±65.86**##2 671.14±294.05** 53.93±4.19** 651.54±58.21**1 231.38±142.83 35.79±3.88 375.15±28.59

2.2 3 組患者血細胞PS、PSGL-1、CD40、CD40L 比較

觀察組、 對照組血細胞PS、PSGL-1 水平及WBC、PLT 上CD40、CD40L 水平均明顯高于健康組（P＜0.01），且觀察組高于對照組（P＜0.05），見表3。

表3 3 組患者血細胞PS、PSGL-1、CD40、CD40L 比較 （±s，%）

表3 3 組患者血細胞PS、PSGL-1、CD40、CD40L 比較 （±s，%）

注：與健康組比較**P＜0.01；與對照組比較#P＜0.05。

組 別觀察組對照組健康組n 60 30 30 PS 41.78±15.32**#28.25±13.01**3.68±1.42 CD40 CD40L WBC PLT WBC PLT 87.36±5.39**# 1.46±0.51**# 2.39±0.48**# 1.38±0.45**# 1.05±0.62**#72.75±3.53** 1.15±0.42** 1.94±0.62** 1.02±0.39** 0.81±0.49**64.75±3.53 0.20±0.19 0.32±0.11 0.23±0.28 0.10±0.04 PSGL-1

3 討論

PLT-WBC 相互反應主要涉及兩對蛋白，即PS/PSGL-1、CD40/CD40L。 PLT-WBC 相互反應促使血小板、白細胞相互聚集、活化，并釋放炎性遞質(zhì)，參與炎癥反應，繼而與斑塊的形成、破裂及血栓的形成密切相關。 痰、瘀作為胸痹心痛的主要病理因素，與西醫(yī)冠心病的斑塊、血栓形成有共同點。 結(jié)果顯示，觀察組PS/PSGL-1、CD40/CD40L 的表達明顯高于健康組，說明PS/PSGL-1、CD40/CD40L 水平的升高， 在冠心病合并頸動脈斑塊發(fā)病中有臨床意義，可用于評價PLT-WBC 相互反應的程度； 觀察組均為痰瘀互結(jié)氣郁證患者， 其PLT-WBC 相關參數(shù)均高于非痰瘀互結(jié)氣郁證的對照組， 因此可以推測PLT-WBC 相關參數(shù)與痰瘀互結(jié)氣郁證可能存在一定關聯(lián)。

體外試驗顯示[8]，PS 的增加并不會隨著時間的延長而發(fā)生逆轉(zhuǎn)，因此PS 被認為是血小板活化的“金標準”。 在血栓性疾病中，通常只有小部分的血小板被活化；凝血酶體外活化血小板，也常表現(xiàn)為亞群激活； 活化的血小板表達CD62 等膜糖蛋白也有明顯的異質(zhì)性[9]。 而有研究表明[10]，PS 不斷從外周血血小板上脫落進入血漿， 隨著血小板保存時間的延長，血漿內(nèi)可溶性PS 濃度升高，這可能是解釋可溶性PS 與血小板體內(nèi)存活期相關性差的理由之一。

CD40L 作為主要表達于活化的T 細胞血小板上的跨膜蛋白，它也以可溶性的形式從細胞上脫落進入血循環(huán)。研究結(jié)果顯示[11]，血小板活化后可釋放微泡， 血小板微泡是循環(huán)血中CD40L 的來源之一，在誘發(fā)炎癥反應后微泡上有CD40L 表達。通過高速離心將可溶性CD40L 和與囊泡結(jié)合的CD40L 分開，酶聯(lián)免疫法雖然可檢測微泡上的CD40L，但僅能觀察炎癥反應發(fā)生后其濃度增加的發(fā)展趨勢。 而流式細胞術不但可明確CD40L 的來源，而且在檢測CD40L 的表達上更為精準。

本次研究通過對同指標不同檢測方法的對比看出， 流式細胞術的檢測比酶聯(lián)免疫法更加精確。且血小板作為血栓形成的重要來源， 極易活化，循環(huán)中的紅細胞、白細胞對其活化均有影響。 抗凝劑的選擇、離心、標本處理不當?shù)榷加锌赡軐е箩t(yī)源性血小板激活從而影響診斷價值。 流式細胞術因其標本處理的簡化、直接標記血細胞從而不受其他種類細胞或碎片的干擾、 能靈敏地檢測少到1%活化血小板亞群使得檢測結(jié)果更加真實等優(yōu)點，已成為靈敏、準確、快速且能運用于臨床常規(guī)檢測血小板膜糖蛋白的表達，評價血小板功能的首選方法。

[1]中華醫(yī)學會心血管分會.慢性穩(wěn)定性心絞痛診斷與治療指南[J].中華心血管病雜志，2007，35(3)：195-205.

[2]中華人民共和國衛(wèi)生部. 冠狀動脈粥樣硬化性心臟病診斷標準[S].北京：中國質(zhì)檢出版社，2010：1-4.

[3]曹 勇.頸動脈超聲與血尿酸檢查在冠心病診斷中的應用研究[J].西部醫(yī)學，2010，22(11)：2 014-2 016.

[4]常建寧. 頸動脈內(nèi)-中層厚度及斑塊性質(zhì)和超敏C 反應蛋白對冠心病的預測研究[J].中西結(jié)合心腦血管病雜志，2010，8(9)：1 050-1 052.

[5]焦樹德，路志正.實用中醫(yī)心病學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：599-620.

[6]鄭筱萸.中藥新藥臨床研究指導原則[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2002：68-73.

[7]中華醫(yī)學會老年醫(yī)學分會.中國健康老年人標準（2013）[J].中華老年醫(yī)學雜志，2013，32(8)：801.

[8]黎慶梅，韋建瑞，洪介民，等.流式細胞術檢測血小板活化的影響因素分析[J].中國病理生理雜志，2009，25(3)：510-512.

[9]Perumal R，Rajendran M，Krishnamurthy M，et al. Modulation of P-selection and platelet aggregation in chronic periodontitis：A clinical study [J]. J Indian Soc Periodontol，2014，18(3)：293-300.

[10]Akada K，Ishikawa S，Yokoyama N，et al. Effects of eicosapentaenoic acid on platelet function in patients taking long-term aspirin following coronary stent implantation [J]. Int Heart J，2014，55(3)：228-233.

[11]Mobarrez F，Sjvik C，Soop A，et al. CD40L expression in plasma of volunteers following LPS administration：A comparison between assay of CD40L on platelet microvesicles and soluble CD40L [J]. Platelets，2014（25）：1-5.