朱曉明 ，李盼，王琳，王宇，張亮，徐元基，杜芝燕，于繼云，閻瑾琦

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；2.解放軍316醫(yī)院，北京 100093

DNA 疫苗具有預(yù)防和治療雙重功效，是一個(gè)功能強(qiáng)大的新型疫苗輸入系統(tǒng)[1]。隨著相關(guān)研究的不斷深入，DNA 疫苗的遞送方式也取得了長(zhǎng)足發(fā)展，目前報(bào)道的主要方法有基因槍法、脂質(zhì)體法、水動(dòng)力法和電穿孔法等。其中，活體電穿孔方法的靶器官選擇范圍廣泛，對(duì)連入的外源基因片段大小沒(méi)有限制，操作簡(jiǎn)便快速，毒性低，具有較高的轉(zhuǎn)染效率，從而成為DNA 疫苗遞送的首選方法[2-3]。但有關(guān)電穿孔遞送的條件還有待深入探討[4]，其中質(zhì)粒的大小是影響遞送效率的重要因素之一。現(xiàn)有含螢光素酶報(bào)告基因的質(zhì)粒pGL3-CMV，但分子較小僅為5 kb，不便于模擬分子較大的DNA 質(zhì)粒進(jìn)行電穿孔遞送條件的研究[5]。因此，我們構(gòu)建了螢光素酶表達(dá)質(zhì)粒pEE14.1-luc，其中pEE14.1 是一種高效表達(dá)載體[6]，分子較大約為11 kb，將螢光素酶報(bào)告基因luc克隆入該載體后的質(zhì)粒分子可達(dá)12.7 kb。以此質(zhì)粒作為大分子質(zhì)粒的代表，為進(jìn)一步摸索遞送10 kb 以上質(zhì)粒的電穿孔條件奠定了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

BALB/c 小鼠購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；293T 細(xì)胞系購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞研究所；大腸桿菌DH5α感受態(tài)由本室制作；含有螢光素酶報(bào)告基因的質(zhì)粒pGL3-CMV 為本室保存；載體pEE14.1 由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院宋宏彬博士贈(zèng)予；限制性?xún)?nèi)切酶HindⅢ、BamHⅠ、EcoRⅠ和DNA 聚合酶KlenowⅠ購(gòu)自New England Biolabs 公司；SolutionⅠ連接酶購(gòu)自TakaRa 公司；DNA 片段回收試劑盒、高純度質(zhì)粒小提試劑盒和無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；螢光素酶底物luck-100 購(gòu)自GOLDB10 公司；一抗為山羊抗螢光素酶抗體，二抗為HRP和FITC分別標(biāo)記的兔抗山羊抗體，購(gòu)自中杉金橋生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞破膜劑購(gòu)自BD 公司；Western 印跡超敏發(fā)光液購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；IVIS 5D imaging system 活體成像儀為Xenogen公司所有。

1.2 重組質(zhì)粒pEE14.1-luc的構(gòu)建及鑒定

用EcoRⅠ單酶切含有螢光素酶報(bào)告基因的重組質(zhì)粒pGL3-CMV，純化回收并將粘性末端補(bǔ)平，再用HindⅢ單酶切，回收l(shuí)uc基因片段；用BamHⅠ單酶切pEE14.1 質(zhì)粒，純化回收后將粘性末端補(bǔ)平，再用HindⅢ單酶切補(bǔ)平后的線(xiàn)性質(zhì)粒pEE14.1，獲得同樣是一平一粘的pEE14.1 載體片段；將純化回收的pEE14.1 載體片段和luc基因片段在SolutionⅠ連接酶的作用下于16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，挑取單克隆菌培養(yǎng)，并進(jìn)行菌液PCR鑒定［引物為F（5'-ATAGGATCCGCCACCATGGAA GACGC-3'）和R（5'-ATTCCCGGGTTACACGGCG ATCTTTC3'）］，將菌液PCR 鑒定為陽(yáng)性的克隆測(cè)序，把測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒命名為pEE14.1-luc。

1.3 重組質(zhì)粒pEE14.1-luc轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞

轉(zhuǎn)染的前1 d 將293T 細(xì)胞接種于6 孔板，當(dāng)細(xì)胞覆蓋到70%～80%時(shí)，用Entranster-H 轉(zhuǎn)染試劑將提取的質(zhì)粒pEE14.1-luc 和空載體pEE14.1 分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 Western 印跡檢測(cè)重組質(zhì)粒pEE14.1-luc 的表達(dá)

收集轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h 的細(xì)胞，離心后棄上清，加入200 μL 細(xì)胞裂解液置冰上裂解40 min～1 h，離心后取上清，加入25 μL 蛋白樣品處理液煮沸5 min，進(jìn)行SDS-PAGE；電泳畢，用Bio-RAD 轉(zhuǎn)移儀將凝膠中的蛋白分子轉(zhuǎn)移到PVDF 膜，用含5%牛血清的TBST 室溫封閉2 h，一抗為1∶500 稀釋的山羊抗螢光素酶抗體，二抗為1∶5000稀釋的HRP標(biāo)記兔抗山羊抗體，用普利萊超敏發(fā)光液顯影。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光法檢測(cè)重組質(zhì)粒pEE14.1-luc的表達(dá)

收集轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h 的細(xì)胞，離心后棄上清，用細(xì)胞打孔液打孔7 min，4℃與抗體孵育30 min，一抗為1∶200稀釋的山羊抗螢光素酶抗體，二抗為1∶1000 稀釋的FITC 標(biāo)記的兔抗山羊抗體，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，再用激光共聚焦掃描顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞表面熒光的表達(dá)情況。

1.6 活體成像技術(shù)檢測(cè)重組質(zhì)粒pEE14.1-luc 的表達(dá)

大量提取重組質(zhì)粒pEE14.1-luc 及對(duì)照質(zhì)粒pGL-3-CMV，在BALB/c 小鼠的左右腿部肌肉組織中分別注射濃度為50 μg/100 μL的pGL-3-CMV 和pEE14.1-luc，并用電穿孔技術(shù)進(jìn)行質(zhì)粒遞送（電壓60 V，脈沖時(shí)間50 ms，放電6 次）。免疫后48 h，將螢光素酶底物luck-100 注射入腹腔，10 min 后將麻醉的小鼠放入活體成像檢測(cè)儀中，觀(guān)察螢光素酶在活體內(nèi)的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pEE14.1-luc的構(gòu)建及鑒定

將重組質(zhì)粒pEE14.1-luc轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ɑ感受態(tài)，挑取單克隆進(jìn)行培養(yǎng)，以培養(yǎng)物為模板，用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR 鑒定。瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，4號(hào)菌液擴(kuò)增出約1700 bp 的片段，與螢光素酶基因片段大小一致（圖1）。將PCR 鑒定正確的4 號(hào)菌液提取質(zhì)粒，送公司測(cè)序，結(jié)果分析證明連入pEE14.1載體中的片段序列與螢光素酶基因序列完全相符，表明重組質(zhì)粒pEE14.1-luc構(gòu)建成功。

2.2 Western印跡檢測(cè)

收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行Western印跡，重組質(zhì)粒pEE14.1-luc 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中有特異性條帶，相對(duì)分子量約為62×103，而空載體pEE14.1 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中未檢測(cè)出特異性條帶，表明重組質(zhì)粒pEE14.1-luc能夠正確表達(dá)螢光素酶（圖2）。

圖1 重組質(zhì)粒pEE14.1-luc的菌液PCR鑒定

2.3 流式細(xì)胞術(shù)及免疫熒光檢測(cè)

對(duì)轉(zhuǎn)染后48 h 的293T 細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)及免疫熒光檢測(cè)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表明，轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒pEE14.1-luc 的293T 細(xì)胞，luc 陽(yáng)性表達(dá)率為22.41%，而未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的對(duì)照組細(xì)胞無(wú)luc 表達(dá)（圖3）。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒pEE14.1-luc 的293T 細(xì)胞有FITC 標(biāo)記的綠色熒光，而未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的對(duì)照組細(xì)胞無(wú)熒光表達(dá)（圖4）。

2.4 活體成像檢測(cè)結(jié)果

將質(zhì)粒pGL3-CMV 和重組質(zhì)粒pEE14.1-luc 分別注射入BALB/c 小鼠的左右腿肌肉內(nèi)，利用電穿孔技術(shù)進(jìn)行質(zhì)粒遞送，48 h 后的活體成像檢測(cè)結(jié)果顯示，小鼠注射質(zhì)粒pEE14.1-luc和pGL3-CMV后的左右腿部均有很強(qiáng)的熒光表達(dá)（圖5）。

3 討論

圖2 重組質(zhì)粒pEE14.1-luc表達(dá)的Western印跡

圖3 重組質(zhì)粒pEE14.1-luc的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

圖4 重組質(zhì)粒pEE14.1-luc的免疫熒光檢測(cè)（×20）

圖5 活體成像檢測(cè)重組質(zhì)粒pEE14.1-luc在體內(nèi)的表達(dá)

DNA 疫苗作為第三代疫苗，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗原特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，具有廣闊的發(fā)展前景[7]。關(guān)于DNA 疫苗體內(nèi)遞送的研究也越來(lái)越受關(guān)注。諸多研究表明，通過(guò)電穿孔技術(shù)遞送DNA 疫苗已成為一種高效的疫苗遞送策略[8]。首先，電穿孔的作用原理非常明確，細(xì)胞在短暫脈沖電壓作用下，細(xì)胞膜出現(xiàn)開(kāi)孔，質(zhì)粒DNA 即可沿孔洞向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移，因此能夠使肌肉細(xì)胞對(duì)質(zhì)粒DNA 的攝入比直接肌肉注射顯著提高[9-10]。其次，電穿孔技術(shù)操作簡(jiǎn)單快捷且成本較低。影響電穿孔遞送的因素較多，除電壓、脈沖次數(shù)、脈沖時(shí)間等[11-12]，質(zhì)粒DNA 的大小、自身特性也是影響遞送效率的重要因素。目前在臨床試驗(yàn)的研究中，電穿孔遞送還未有統(tǒng)一的參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)[13]，各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)有待完善。

近年來(lái)，活體成像技術(shù)成為檢測(cè)活體動(dòng)物體內(nèi)基因表達(dá)的研究熱點(diǎn)。此技術(shù)是在生物體處于活體的狀態(tài)下，通過(guò)采用多種成像模式的方法，對(duì)生物體在細(xì)胞和分子水平上進(jìn)行定性和定量分析研究。這項(xiàng)技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：首先是在近乎無(wú)創(chuàng)的條件下對(duì)活體動(dòng)物體內(nèi)的生物學(xué)表現(xiàn)進(jìn)行成像跟蹤，無(wú)須處死動(dòng)物，簡(jiǎn)單可行；其次是操作便捷，短時(shí)間內(nèi)便可動(dòng)態(tài)、連續(xù)、直觀(guān)地觀(guān)察到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，一目了然，具有極高的靈敏度[14]。我們將該技術(shù)運(yùn)用于本實(shí)驗(yàn)，對(duì)質(zhì)粒DNA 在體內(nèi)的表達(dá)情況進(jìn)行了可視化評(píng)估，為實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供了客觀(guān)、可靠的理論基礎(chǔ)。

本研究中應(yīng)用的pEE14.1 載體較大約為11 kb，我們將螢光素酶報(bào)告基因克隆入該真核表達(dá)載體，所構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒可作為大分子模式質(zhì)粒的代表。Western 印跡、流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光方法檢測(cè)表明螢光素酶能在體外細(xì)胞中表達(dá)；利用電穿孔方法在小鼠腿部肌肉中進(jìn)行重組質(zhì)粒pEE14.1-luc 的遞送，活體成像結(jié)果顯示小鼠腿部肌肉中有較強(qiáng)的熒光表達(dá)。這說(shuō)明我們構(gòu)建的重組質(zhì)粒pEE14.1-luc在活體動(dòng)物中得到了很好的表達(dá)，為電穿孔遞送較大分子質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。

[1]Ghanem A,Healey R,Adly F G.Current trends in separation of plasmid DNA vaccines:a review[J].Anal Chim Acta,2013,760:1-15.

[2]Sardesai N Y,Weiner D B.Electroporation delivery of DNA vaccines:prospects for success[J].Curr Opin Immunol,2011,23(3):421-429.

[3]Gothelf A,Gehl J.What you always needed to know about electroporation based DNA vaccines[J].Hum Vaccin Immunother,2012,8(11):1694-1702.

[4]van Drunen Littel-van den Hurk S,Hannaman D.Electroporation for DNA immunization:clinical application[J].Exp Rev Vaccines,2010,9(5):503-517.

[5]李盼,張亮,王宇,等.復(fù)制子螢光素酶表達(dá)質(zhì)粒pSVK-luc 的構(gòu)建與應(yīng)用[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2013,29(7):765-768.

[6]高燕,汪習(xí),張巍,等.人干擾素α高效表達(dá)質(zhì)粒pEE14.1-IFNα的構(gòu)建和表達(dá)[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2012,28(4):381-383.

[7]楊海,王芳宇.DNA 疫苗的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù),2013,40(1):72-76.

[8]Murakami T,Sunada Y.Plasmid DNA gene therapy by elec-troporation:principles and recent advances[J].Curr Gene Ther,2011,11(6):447-456.

[9]Andre F,Mir L M.DNA electrotransfer:its principles and an updated reviewof its therapeutic applications[J].Gene Ther,2004,11(Suppl 1):33-42.

[10]Wells D J.Gene therapy progess and prospects:electroporation and other physical metehods[J].Gene Ther,2004,11(18):1363-1369.

[11]Bodles-Brakhop A M,Draghia-Akli R.DNA vaccination and gene therapy:optimization and delivery for cancer therapy[J].Expert Rev Vaccines,2008,7(7):1085-1101.

[12]Rabussay D.Applicator and electrode design for in vivo DNA delivery by electroporation[J].Methods Mol Biol,2008,423:35-59.

[13]Reed S D,Li S.Electroporation advances in large animals[J].Curr Gene Ther,2009,9(4):316-326.

[14]宿華威,韓德恩,吳德全,等.活體生物螢光成像技術(shù)及新進(jìn)展[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2006,40(4):342-344.