徐一凱，楊珺超

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州 310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江杭州 310006）

防感煎劑系浙江省中醫(yī)院國(guó)家級(jí)名老中醫(yī)的經(jīng)驗(yàn)方，主要由荊芥10g，防風(fēng)10g，前胡10g，板藍(lán)根 10g，大青葉 10g，黃芩 10g，杏仁 10g，白芷 10g，陳皮6g組成。方中諸藥寒溫并用，功能解表散寒、清熱解毒、宣肺利氣，經(jīng)長(zhǎng)期臨床使用證實(shí)：該藥有較好的防治流感效果。前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示防感煎劑有很好的直接抑制甲1型流感病毒作用以及調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫功能作用[1]，可以減輕肺部炎癥損害，有利于病毒感染的控制；體外抑制試驗(yàn)的研究結(jié)果表明防感煎劑可以阻止病毒吸附于易感細(xì)胞[2]。本實(shí)驗(yàn)從小鼠TNF-α和IL-6細(xì)胞因子的表達(dá)入手，進(jìn)一步揭示防感煎劑抗病毒感染的免疫機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)ICR小鼠（二級(jí)）96只，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

防感煎劑所需中藥購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房，藥物品系和質(zhì)量合格。藥材鑒定人：錢松洋，主任中藥師。按常規(guī)方法煎煮2次，將前后兩次煮液合并，過(guò)濾，所得濾液進(jìn)行濃縮，最終使用藥物劑量為29.32g/kg（經(jīng)前期實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證為最佳藥物濃度）[1]。實(shí)驗(yàn)使用藥物劑量為29.32g/kg。磷酸奧司他韋（達(dá)菲）膠囊，75mg/粒，批號(hào) E1284，羅氏大藥廠香港有限公司。

1.3 病毒

甲1型流感病毒鼠肺適應(yīng)株（FM1），由浙江省疾病預(yù)防與控制中心病毒所提供。經(jīng)測(cè)定，該病毒對(duì)小鼠的 LD50為 10-4/20μl。

1.4 實(shí)驗(yàn)試劑

小鼠腫瘤壞死因素（TNF-α）ELISA試劑盒，批號(hào) 1207283；小鼠白介素-6（IL-6）ELISA 試劑盒，批號(hào)1207281均由美國(guó)R&D公司分裝，上海西唐生物科技有限公司提供。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素 ANOVA，組間兩兩比較，方差齊性時(shí)用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)用Tamhane's T2檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組及用藥情況

小鼠按體重分層隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、防感煎劑組、達(dá)菲對(duì)照組，每組24只。按照體型系數(shù)換算法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人用藥量的換算，防感煎劑組給藥量劑量為29.32g/kg；達(dá)菲對(duì)照組給藥劑量為0.02g/kg，正常對(duì)照組和模型組以生理鹽水灌胃，每天1次，每次0.25mL/10g，分別灌胃給藥，先正常給藥2d，第3-8天在甲1型流感病毒液滴鼻感染造模后2h灌胃給藥，共給藥8d。

2.2 造模方法

給藥第3天，小鼠用乙醚輕度麻醉后，正常對(duì)照組以生理鹽水滴鼻，其余各組以10LD50的甲1型流感病毒液滴鼻感染，每只20μL，以滴鼻造模的次日為病毒感染后第1天，每組小鼠分別于感染后第1，5，9，13 天隨機(jī)取小鼠動(dòng)態(tài)觀察毛色，皮膚，反應(yīng)速度（對(duì)一般刺激）等情況。

3 結(jié)果

3.1 小鼠一般情況的變化

正常組小鼠毛色光潔，呼吸平穩(wěn)，活潑好動(dòng)，反應(yīng)靈敏，飲食正常，而病毒感染的72只小鼠不久即出現(xiàn)不同程度的形體消瘦，毛色干枯，反應(yīng)遲鈍。各藥物干預(yù)組隨著藥物的應(yīng)用，癥狀明顯較模型組減輕。模型組形體消瘦，毛色枯槁，精神萎靡、反應(yīng)遲鈍，飲食減少。達(dá)菲組較模型組、防感煎劑組毛色稍潤(rùn)澤，反應(yīng)稍靈敏。

3.2 RT-PCR檢測(cè)感染小鼠流感病毒含量

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)流感病毒含量結(jié)果顯示：第1天，第5天，防感煎劑組病毒含量低于模型對(duì)照組（P＜0.05）；第9天防感煎劑的病毒含量低于模型對(duì)照組，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異（P＞0.05）；第13天防感煎劑組病毒含量低于模型對(duì)照組（P＜0.05或P＜0.01）。從表6中可以看出，感染后第5天病毒含量達(dá)到峰值，第9天起不再繼續(xù)增高，而經(jīng)防感煎劑處理后，病毒高峰仍在第5天出現(xiàn)，但無(wú)論是病毒感染初期，中期及后期病毒含量都明顯下降。見(jiàn)表1

表1 病毒含量 （單位：copies/μl）

3.3 血清中細(xì)胞因子的表達(dá)

3.3.1 血清TNF-α因子表達(dá)

感染后各組小鼠血清TNF-α隨時(shí)間呈升高趨勢(shì)。但在感染初期（第1天）和感染中期（第5天）各組之間TNF-α表達(dá)無(wú)明顯差異。感染后期（第9天、第13天）時(shí)模型對(duì)照組TNF-α明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.01），防感煎劑組和達(dá)菲對(duì)照組明顯低于模型對(duì)照組（P＜0.05，P＜0.01），但兩組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），與正常對(duì)照組比較也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。提示：病毒感染后期TNF-α表達(dá)增加，防感煎劑能抑制TNF-α的表達(dá)。見(jiàn)表2

表2 血清TNF-α表達(dá) （單位：pg/mL）

3.3.2 血清IL-6因子表達(dá)

感染后各組小鼠血清IL-6隨時(shí)間呈升高趨勢(shì)。但在感染初期（第1天）和感染中期（第5天）各組之間IL-6表達(dá)無(wú)明顯差異。感染后期（第9天、第13天）時(shí)模型對(duì)照組IL-6明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.01），防感煎劑組和達(dá)菲對(duì)照組明顯低于模型對(duì)照組（P＜0.05，P＜0.01），但兩組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），與正常對(duì)照組比較也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。提示：病毒感染后期IL-6表達(dá)增加，防感煎劑能抑制IL-6的表達(dá)。見(jiàn)表3。

表3 血清IL-6表達(dá) （單位：pg/mL）

4 討論

流感是由流行性流感病毒引起的急性呼吸道傳染病。流感病毒發(fā)病率高、傳染性強(qiáng)、致死率高，其中甲型流感病毒的抗原變異性最大，曾3次導(dǎo)致世界性大流行的流感[3]。其中感染人類并能夠引起一定范圍流行的甲型流感病毒包括甲1（H1N1）和甲3（H3N2）型[4]。病毒感染機(jī)體后，可啟動(dòng)宿主免疫應(yīng)答，形成炎癥反應(yīng)和炎癥免疫病理?yè)p傷。在免疫病理?yè)p傷過(guò)程中，涉及多種免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子，而中醫(yī)藥在調(diào)節(jié)機(jī)體和細(xì)胞免疫方面有明顯的優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)代的中藥研究顯示[5]，有些中藥可直接滅活或抑制病毒，有些中藥則通過(guò)誘生干擾素或調(diào)節(jié)人體免疫功能而發(fā)揮間接抗病毒作用。而復(fù)方中藥，其有效成分多，能從多環(huán)節(jié)調(diào)節(jié)機(jī)體的細(xì)胞免疫，因而能為病毒感染過(guò)程中引起炎癥免疫病理性損傷的治療提供新的研究思路。

研究發(fā)現(xiàn)激活的巨噬細(xì)胞，能增強(qiáng)促炎性細(xì)胞因子的分泌，包括IL-6和TNF-α[6-7]。而IL-6，TNF-α等炎性細(xì)胞因子通過(guò)趨化、活化淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等，產(chǎn)生免疫病理?yè)p傷；另一方面，這些細(xì)胞因子可直接作用于細(xì)胞、微血管等，造成組織損傷[8]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明防感煎劑能明顯改善小鼠一般狀況，降低小鼠肺組織中H1N1病毒含量，抑制TNF-α、IL-6等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，并且與達(dá)菲組比較效果相當(dāng)。說(shuō)明防感煎劑可抑制H1NI病毒復(fù)制，在病毒感染引起的免疫病理?yè)p傷過(guò)程中發(fā)揮作用，通過(guò)抑制細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的表達(dá)，從而減輕由炎性介質(zhì)過(guò)度釋放引起的免疫病理?yè)p傷，從而來(lái)控制感染、改善癥狀。

[1]汪玉冠，宋康，駱仙芳，等.防感煎劑對(duì)甲1型流感病毒感染小鼠T細(xì)胞亞群及活化的影響 [J].中國(guó)中醫(yī)藥科技，2012，19（1）：22-24.

[2]宋康.防感煎劑含藥血清體外抑制甲1型流感病毒作用的實(shí)驗(yàn)研究[C].第十次全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合防治呼吸系統(tǒng)疾病學(xué)術(shù)研討會(huì)，2009.

[3]Carolien E.van de Sandt，Joost H.C.M.Kreijtz，Guus F.Rimmelzwaan.Evasion of Influenza A viruses from Innate and Adaptive Immune Responses[J].Viruses，2012 September，4（9）：1438-1476.

[4]WHO.Influenza（seasonal）fact sheet N°211.[EB/OL].[2009 April].http：//www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/index.html.

[5]黃海英，宋輝.抗流感病毒中藥研究進(jìn)展[J].實(shí)用中醫(yī)藥雜志，2012，28（5）：439-440.

[6]van Riel D. ，Leijten L.M.，van der Eerden M.Highly pathogenic avian influenza virus H5N1 infects alveolar macrophages without virus production or excessive TNF-alpha induction[J].PLoSPathog，2011，7：e1002099.

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[8]Campbell D.J.，Koch M.A.Phenotypical and functional specialization of FOXP3+regulatory T cells[J].Nat.Rev，2011（11）：119-130.