劉 陽，王李瑤，張慶華，夏鶴春 ，孫 濤

0 引 言

腦出血、腦外傷、神經(jīng)退行性疾病、腦腫瘤等疾病都與神經(jīng)細(xì)胞的凋亡有著密切聯(lián)系。研究表明Caspase在神經(jīng)系統(tǒng)疾病細(xì)胞凋亡進(jìn)程中起到的很重要的作用［1-2］。Caspase通過外源性途徑或內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑激活介導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡，通過釋放線粒體細(xì)胞色素C到細(xì)胞質(zhì)，活化Caspase 9和隨后其他Caspases，其中Caspase 9處于凋亡有序級(jí)聯(lián)反應(yīng)的上游可激活下游Caspase3，進(jìn)而誘導(dǎo)蛋白水解酶作用于關(guān)鍵調(diào)解蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白最終使細(xì)胞凋亡［3-4］。

?；撬?taurine)是人體內(nèi)含量較高的游離氨基酸，是一種條件必需氨基酸，在細(xì)胞中發(fā)揮著多種作用，如滲透壓調(diào)節(jié)、細(xì)胞質(zhì)鈣水平的調(diào)節(jié)、生長(zhǎng)發(fā)育營(yíng)養(yǎng)因子等。研究表明?；撬釋?duì)神經(jīng)系統(tǒng)有較強(qiáng)的保護(hù)作用［5］。本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞，采用谷氨酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，觀察不同濃度?；撬釋?duì)海馬神經(jīng)元凋亡的抑制作用，研究?；撬釋?duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 小鼠永生性海馬神經(jīng)元細(xì)胞株HT_22購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。Caspase 9抗體購(gòu)自cell signal technology公司，谷氨酸、?；撬豳?gòu)自Sigma公司，BetaActin、DAPI購(gòu)自博奧森公司，二抗、FITC標(biāo)記二抗購(gòu)自北京中杉金橋公司，MTT試劑盒購(gòu)自trevigen公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將小鼠永生性海馬神經(jīng)元細(xì)胞株HT_22置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱，用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，取生長(zhǎng)良好的第5～8代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且細(xì)胞活性＞80%的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

將細(xì)胞密度調(diào)整為1×105個(gè)/mL，按以下條件進(jìn)行分組:正常HT_22細(xì)胞為對(duì)照組;HT_22細(xì)胞加入終濃度為4 mmol/L谷氨酸為損傷凋亡組;HT_22細(xì)胞加入終濃度為4 mmol/L谷氨酸和0.5 mmol/L?；撬釣榈蛣┝勘Ｗo(hù)組;HT_22細(xì)胞加入終濃度為4 mmol/L谷氨酸和2 mmol/L?；撬釣楦邉┝勘Ｗo(hù)組。各組繼續(xù)培養(yǎng)24 h后終止。

1.2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)觀察 各組干預(yù)培養(yǎng)24 h后，倒置顯微鏡下選擇5個(gè)視野，觀察細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞形態(tài)，以及神經(jīng)元間網(wǎng)絡(luò)的形成。

1.2.3 MTT檢測(cè)各組細(xì)胞生長(zhǎng)活力 將細(xì)胞密度調(diào)整為1×105個(gè)/mL，每孔100 uL接種于96孔板。生長(zhǎng)24h后，按各個(gè)分組加入相應(yīng)干預(yù)后將96孔板培養(yǎng)24 h，漂洗細(xì)胞2次后加入90 μL新鮮培養(yǎng)液。再加入5 g/L MTT 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后去上清。每孔加入110 μL Formazan溶解液，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。490 nm處檢測(cè)各孔吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果取每組6個(gè)復(fù)孔平均值。計(jì)算公式:

A值=(1-實(shí)驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值×100%

1.2.4 細(xì)胞免疫化學(xué)熒光檢測(cè)Caspase 9表達(dá)細(xì)胞生長(zhǎng)24 h后，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，無血清培養(yǎng)6 h。吸出培養(yǎng)基，按以上設(shè)計(jì)方法進(jìn)行分組干預(yù)。按分組接種在12孔板中的無菌蓋玻片上。加入谷氨酸及牛磺酸干預(yù)后24 h，4%多聚甲醛固定液固定 30 min，TritonX-100，37℃滲透 30 min，10%山羊血清封閉30 min，添加一抗4℃孵育12～16 h，滴加1∶200的 FITC 標(biāo)記的二抗，37℃溫箱孵育1 h，甘油封片10 min。熒光顯微鏡觀察到適宜亮度且圖像清晰的細(xì)胞染色，拍照，進(jìn)一步分析圖像表達(dá)結(jié)果。

1.2.5 Western blot檢測(cè)Caspase 9蛋白的表達(dá) 提取不同處理組的細(xì)胞總蛋白，計(jì)算50 μg蛋白上樣量。電泳(5%濃縮膠，80 V，30 min;10%分離膠120 V，90 min)。濕轉(zhuǎn)，260 mA，90 min，封閉 1 h 后一抗(1∶500)，4℃孵育過夜。二抗(1∶1000)，室溫孵育1 h，進(jìn)入暗室曝光。實(shí)驗(yàn)結(jié)果在凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描和密度分析，以所測(cè)目的蛋白與β-actin的比值作為該目的蛋白的定量指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。多組均數(shù)的比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組間兩兩比較視方差齊性檢驗(yàn)(以0.1作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)進(jìn)行Levene檢驗(yàn))結(jié)果進(jìn)行不同的選擇，當(dāng)方差齊同時(shí)，選擇LSD檢驗(yàn)，當(dāng)方差不齊時(shí)，選擇Tamhane's T2檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)觀察 在倒置相差顯微鏡下觀察，對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量多，海馬神經(jīng)元胞體多呈不規(guī)則橢圓形或三角形，有細(xì)長(zhǎng)的突起且互相連接成網(wǎng);損傷凋亡組細(xì)胞數(shù)量少，神經(jīng)元樣細(xì)胞突起短，網(wǎng)絡(luò)稀疏;?；撬岜Ｗo(hù)組較損傷組細(xì)胞數(shù)量較多，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞突起長(zhǎng)。見圖1。

2.2 MTT監(jiān)測(cè)細(xì)胞存活力 對(duì)照組、損傷凋亡組、低劑量保護(hù)組、高劑量保護(hù)組MTT相對(duì)A值分別為0.643 ±0.013、0.102 ±0.025、0.504 ±0.072和0.452±0.029，損傷凋亡組細(xì)胞活力較對(duì)照組和低、高劑量保護(hù)組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

圖1 倒置顯微鏡下海馬神經(jīng)元細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)(×400)Figure 1 Morphology of the neuronal cells(×400)

2.3 免疫熒光檢測(cè)Caspase 9表達(dá) 免疫熒光結(jié)果顯示損傷凋亡組Caspase 9的陽性表達(dá)(A值為61386.8±10 083.6)較對(duì)照組(A 值為 4 502.2 ±2518.1)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。低、高劑量保護(hù)組Caspase 9的陽性表達(dá)(A值分別為20077.4 ±4187.5和 13976.2 ±7044.1)比損傷凋亡組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖2。

圖2 Caspase 9免疫熒光圖(×400)Figure 2 Expression of Caspase 9 in different groups detected by immunofluorescence(×400)

2.4 Western blot檢測(cè)Caspase 9在各組中的表達(dá)與免疫熒光各組表達(dá)同步，在損傷凋亡組Caspase 9的陽性表達(dá)(A值為1.23)較對(duì)照組(A值為0.17)明顯增高。低、高劑量保護(hù)組Caspase 9的陽性表達(dá)(A值分別為0.21和0.19)比損傷凋亡組明顯降低。見圖3。

圖3 Caspase 9在各組中的表達(dá)Figure 3 Expression of Caspase 9 in different groups detected by Western blot

3 討 論

Caspases被認(rèn)為是一個(gè)調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的蛋白酶家族，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中，半胱天冬酶在神經(jīng)系統(tǒng)中逐漸下調(diào)，但繼續(xù)履行重要的非凋亡功能與神經(jīng)發(fā)生和突觸可塑性相關(guān)。在神經(jīng)退行性疾病，異常神經(jīng)元死亡是一個(gè)突出的特點(diǎn)，同時(shí)伴隨是Caspase活性的增加，研究表明Caspase介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在神經(jīng)退行性疾病、腦缺血、腦腫瘤等疾病中發(fā)揮了重要作用［6］。正常狀態(tài)下Caspase家族蛋白酶以無活性的酶原存在，它的活化主要有外源性途徑和內(nèi)源性途徑。其中Caspase 9介導(dǎo)的是細(xì)胞凋亡中的內(nèi)源途徑也叫線粒體途徑。線粒體直接或間接釋放凋亡因子1(apoptosis protease-activating factor-1，Apaf-1)和細(xì)胞色素C。在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞色素C與Apaf-1聚合Caspase 9，這導(dǎo)致了Caspase 9的活化，活化的Caspase 9激活下游的Caspase 3，后者直接引起細(xì)胞凋亡?；罨腃aspase 3可以激活核因子、細(xì)胞骨架蛋白及DNA修復(fù)酶等，促使染色質(zhì)凝聚和核酶激活，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［7-9］。Caspase 3是細(xì)胞凋亡的最終執(zhí)行者，Caspase 9在凋亡起始中具有重要作用［10］。在本實(shí)驗(yàn)中采用經(jīng)典損傷模型，既谷氨酸誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元的凋亡，損傷組較對(duì)照組明顯生長(zhǎng)不良，凋亡率升高同時(shí)免疫熒光和蛋白印跡監(jiān)測(cè)Caspase 9的表達(dá)明顯升高，可見Caspase 9的活化與海馬神經(jīng)元的凋亡密切相關(guān)。

牛磺酸是一種含硫的非蛋白氨基酸，在體內(nèi)以游離狀態(tài)存在，不參與體內(nèi)蛋白的生物合成，具有廣泛的細(xì)胞保護(hù)作用。研究表明?；撬崤c中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常生理功能的維持有密切關(guān)系，其在大腦皮質(zhì)、海馬和小腦等區(qū)域特異性分布，具有促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)生長(zhǎng)發(fā)育、增殖分化、增強(qiáng)記憶、延緩衰老等作用［11］。?；撬釋?duì)神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的保護(hù)作用尚未完全明確，可能是以下幾個(gè)機(jī)制的綜合作用:①?；撬嵩谥袠猩窠?jīng)系統(tǒng)內(nèi)作為一種抑制性氨基酸可對(duì)抗興奮性氨基酸，如谷氨酸、天冬氨酸等，通過包括防止膜去極化，抑制神經(jīng)細(xì)胞的興奮性毒性和線粒體能量衰竭，保護(hù)目標(biāo)包括細(xì)胞膜，線粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜［12-13］。②?；撬嶙柚辜?xì)胞內(nèi)自由基的過氧化，拮抗細(xì)胞內(nèi)氧化還原損傷。③牛磺酸有調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)游離鈣水平的功能，通過抑制鈣離子內(nèi)流，減弱細(xì)胞的去極化趨勢(shì)，保護(hù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能［14-15］。通過以上作用降低了細(xì)胞線粒體的損傷及其各種蛋白酶的穩(wěn)定，抑制了Caspase 9介導(dǎo)的線粒體途徑的凋亡進(jìn)程。在本實(shí)驗(yàn)中通過在損傷模型中加入不同劑量?；撬岣深A(yù)后，可見神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，MTT測(cè)得凋亡率明顯下降，免疫熒光和蛋白印跡檢測(cè)Caspase 9的表達(dá)量明顯下降，可見?；撬峥擅黠@降低Caspase 9的活化從而抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡進(jìn)程起到了很好的神經(jīng)保護(hù)作用，為?；撬嵩谏窠?jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用提供了理論支撐。

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