李建民，趙雅寧，馬榮麗，竇 娜，陳長香，李淑杏，張 盼

0 引 言

彌漫性顱腦損傷(diffuse brain injury，DBI)成為兒童和青少年死亡或殘疾的最常見病因［1］，其病理機(jī)制包括興奮性氨基酸毒性作用、氧化應(yīng)激、鈣離子超載、炎性反應(yīng)、電解質(zhì)代謝紊亂及神經(jīng)細(xì)胞凋亡等所造成的腦組織繼發(fā)性損害［2］。研究顯示通過減少顱腦損傷病理過程中有害因子的產(chǎn)生可對(duì)腦組織產(chǎn)生一定的保護(hù)作用［3］。Homer是一種主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，其家族大致可分為Homer1、Homer2和 Homer3等 3個(gè)類型，其中Homer1a第1個(gè)被認(rèn)識(shí)，其受多種刺激因素調(diào)控，可選擇性阻斷Homerlb/c與代謝型谷氨酸受體的結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的釋放，從而影響突觸的可塑性。近期有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)Homer1a參與腦損傷的病理過程［4-5］。目前關(guān)于DBI后Homer1a與神經(jīng)細(xì)胞丟失之間的關(guān)系尚不清楚。本研究建立大鼠DBI模型，觀察DBI大鼠海馬區(qū)Homer1a蛋白表達(dá)變化、凋亡神經(jīng)細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化，以探討重型DBI大鼠海馬區(qū)Homer1a蛋白表達(dá)與神經(jīng)細(xì)胞丟失的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組和模型制備 健康清潔級(jí)SD成年雄性大鼠，104只，體重310 ～350 g、平均(328 ±10)g，由河北聯(lián)合大學(xué)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):SCXK(京)2002-003。隨機(jī)數(shù)字法分為對(duì)照組(n=35)和DBI組(n=69)。每組又分為 1、6、24、48、72 h 5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)亞組。DBI組:參照文獻(xiàn)［6］制作大鼠DBI模型。對(duì)照組只進(jìn)行乙醚麻醉而不致傷。模型制作過程中DBI組死亡動(dòng)物34只，死亡率49.3%。

1.2 腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察 光鏡:各組在規(guī)定時(shí)間點(diǎn)按隨機(jī)數(shù)字列表法取3只大鼠，以0.4%戊巴比妥納麻醉動(dòng)物，開胸、暴露心臟，4%多聚甲醛行心臟灌流，斷頭取腦，在視交叉后1mm和6mm處冠狀面切開，取中間塊入4%多聚甲醛固定液固定，石蠟包埋，切片(片厚5 μm)，進(jìn)行HE染色。存活神經(jīng)細(xì)胞密度定量分析:每個(gè)標(biāo)本取5張切片，在光學(xué)顯微鏡(×200)下觀察海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)，將海馬區(qū)平均分為3份，每個(gè)等份選取一個(gè)相同部位，應(yīng)用Motic-6.0圖像采集及圖像分析系統(tǒng)分別計(jì)數(shù)其中每個(gè)視野(×200)下存活神經(jīng)元數(shù)量及總細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算存活神經(jīng)細(xì)胞百分率(%)。電鏡:每組各時(shí)間點(diǎn)取1只大鼠。迅速斷頭取腦，冰臺(tái)上分離大腦海馬區(qū)組織，切成1 mm×1 mm×1 mm組織塊，立即以4%戊二醛固定，0.1 mol/L二甲砷酸緩沖液沖洗2遍，1%四氧化鋨固定，再經(jīng)緩沖液沖洗，逐級(jí)丙酮脫水，環(huán)氧樹脂浸透，包埋，超薄切片，醋酸鈾枸櫞酸鉛染色。透射電鏡(H-7650，日本)觀察腦組織超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.3 免疫組化法檢測(cè)Homer1a蛋白 切片(組織切片來源與光鏡組織相同)常規(guī)脫蠟，枸櫞酸鹽微波修復(fù)，滴加Homer1a抗體(1∶200)，濕盒中4℃過夜，IgG抗體-HRP多聚體(PV二步法)，37℃溫箱30 min，DAB顯色，脫水、透明、封固。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。鏡下觀察并攝片。陽性率的定量分析:每個(gè)標(biāo)本取5張切片，在有測(cè)微尺的光學(xué)顯微鏡(×200)下觀察Homer1a陽性細(xì)胞數(shù)量，具體方法:將海馬區(qū)平均分為5份，每份選取相同部位，應(yīng)用Motic-6.0圖像采集及圖像分析系統(tǒng)分別觀察海馬區(qū)陽性細(xì)胞變化并計(jì)數(shù)(×200)倍視野下的陽性細(xì)胞數(shù)量及總細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算陽性細(xì)胞百分率(%)表示。

1.4 免疫印跡法檢測(cè)Homer1a蛋白 每組規(guī)定時(shí)間點(diǎn)3只大鼠，致死后迅速取雙側(cè)海馬區(qū)組織，稱量為0.6g，4℃ PBS充分洗滌，加入3倍體積的4℃全細(xì)胞裂解液，冰浴中勻漿，以離心半徑20 cm、12 000 r/min，4℃離心5 min，取上清?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)各樣本的蛋白含量，樣本貯存于-80℃?zhèn)溆?。檢測(cè)步驟:蛋白樣品50 μg與等體積上樣緩沖液混合，煮沸10 min，100 g/L十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜，封閉液室溫下震蕩2～3h，加入Homer1a抗體(1∶2000)，4℃孵育過夜，TBST 洗膜，標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h，TBST洗膜，ECL顯色，用圖像分析儀測(cè)定光密度，作定量分析。

1.5 原位缺口末端標(biāo)記法(in situ nick-end labeling，TUNEL)原位檢測(cè)細(xì)胞凋亡 切片(組織切片來源與光鏡組織相同)常規(guī)脫蠟至水，滴加蛋白酶K，濕盒中37℃孵育30 min，滴加TUNEL混合溶液(購于 Roche公司)，50 μL/片，濕盒中 37℃ 孵育60 min，滴加轉(zhuǎn)化劑 AP，50 μL/片，濕盒中 37 ℃ 孵育30 min，DAB顯色，脫水，透明，封固。陽性率的定量分析:每個(gè)標(biāo)本取5張切片，應(yīng)用Motic-6.0圖像采集及圖像分析系統(tǒng)分別觀察海馬區(qū)陽性細(xì)胞變化并計(jì)數(shù)(×200)倍視野下的陽性細(xì)胞數(shù)量及總細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptoticindex，AI)，AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用t檢驗(yàn)以及Pearson方法兩兩相關(guān)分析，以P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化 DBI組大鼠腦組織可見出血點(diǎn)，但無明顯挫裂灶，光鏡下可見腦組織廣泛水腫，血管腔擴(kuò)大、充血;DBI組6 h可見散在變性壞死的神經(jīng)元，神經(jīng)細(xì)胞胞體收縮呈三角形，細(xì)胞質(zhì)嗜色性減弱，核皺縮濃染，細(xì)胞周圍出現(xiàn)空隙;DBI組72 h視野內(nèi)可見有核溶解及神經(jīng)元細(xì)胞空泡樣變，細(xì)胞間隙顯著增寬。與對(duì)照組比較，DBI組海馬區(qū)各時(shí)間點(diǎn)存活神經(jīng)細(xì)胞百分率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見圖1，表1。

圖1 大鼠海馬區(qū)HE染色結(jié)果(×200)Figure 1 HE staining of the cerebral hippocampus in different groups(×200)

電鏡下對(duì)照組神經(jīng)元神經(jīng)細(xì)胞形狀規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體豐富，細(xì)胞核形狀規(guī)則，核膜完整，染色質(zhì)均勻;對(duì)照組軸索排列整齊，結(jié)構(gòu)完成;DBI組24 h神經(jīng)細(xì)胞外形不規(guī)則、核膜斷裂，染色質(zhì)聚集靠邊;軸索排列紊亂、腫脹，髓鞘泡鼓、內(nèi)折、分層，此外還可觀測(cè)到毛細(xì)血管周圍水腫，腫脹變性神經(jīng)元中大量細(xì)胞器堆積等等。結(jié)合動(dòng)物死亡率和組織形態(tài)改變，本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制作成功［6］。見圖2。

圖2 大鼠海馬區(qū)電鏡結(jié)果(×200)Figure 2 Electron of the cerebral hippocampus in different groups(×200)

2.2 免疫組化法及免疫印跡法檢測(cè)Homer1a蛋白結(jié)果 Homer1a陽性表達(dá)主要位于神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)或突起的棕黃色顆粒。對(duì)照組大鼠海馬區(qū)只有極少量的陽性細(xì)胞。與對(duì)照組比較，DBI組Homer1a陽性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)目增多，6 h出現(xiàn)峰值，高表達(dá)狀態(tài)持續(xù)至24 h、48 h和72 h雖有下降，但仍明顯高于對(duì)照組(P ＜0.05)，見圖3，表1。

圖3 免疫組化檢測(cè)海馬區(qū)Homer1a表達(dá)(×200)Figure 3 Results of Homer1a immunohistochemistry in hippocampus in different groups(×200)

免疫印跡:Homer1a條帶清晰，以β-actin的吸光度值作為內(nèi)參照，對(duì)各組條帶的吸光度值進(jìn)行校正和半定量分析。與對(duì)照組比較，DBI組中各時(shí)間點(diǎn)Homer1a蛋白均增高，6 h出現(xiàn)峰值，高表達(dá)狀態(tài)持續(xù)至24 h，48 h和72 h下降，但仍高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖4，表2。

圖4 Western blot檢測(cè)各組大鼠海馬區(qū)Homer1a表達(dá)Figure 4 Results of Homer1a Western blot in hippocampus in different groups

2.3 神經(jīng)細(xì)胞凋亡變化 凋亡神經(jīng)細(xì)胞表現(xiàn)細(xì)胞核固縮呈棕黃色。對(duì)照組海馬區(qū)只有極少數(shù)陽性細(xì)胞。與對(duì)照組比較，DBI組從傷后6 h TUNEL陽性細(xì)胞逐漸增多，72達(dá)高峰，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見圖5，表2。

圖5 大鼠海馬區(qū)TUNEL檢測(cè)結(jié)果(×200)Figure 5 Results of TUNEL in hippocampus in different groups(×200)

表1 大鼠海馬區(qū)存活神經(jīng)細(xì)胞百分率及Homer1a陽性細(xì)胞百分率比較(±s，%，n=3)Table 1 Comparison of the survival rate of survival nerve cells in hippocampus(±s，%，n=3)

表1 大鼠海馬區(qū)存活神經(jīng)細(xì)胞百分率及Homer1a陽性細(xì)胞百分率比較(±s，%，n=3)Table 1 Comparison of the survival rate of survival nerve cells in hippocampus(±s，%，n=3)

與對(duì)照組比較，*P ＜0.05

組別 各時(shí)間點(diǎn)存活神經(jīng)細(xì)胞率各時(shí)間點(diǎn)Homer1a陽性率1 h 6 h 24 h 48 h對(duì)照組 99.4 ±0.6 99.3 ±0.7 99.5 ±0.5 99.4 ±0.6 99.2 ±0.8 1.26 ±0.10 1.30 ±0.10 1.28 ±0.10 1.32 ±0.11 1 h 6 h 24 h 48 h 72 h DBI組 94.4 ±5.6* 89.6 ±10.8* 72.2 ±19.6* 63.5 ±22.7* 54.7 ±33.8* 24.96 ±7.68* 58.84 ±9.62* 57.96 ±8.74* 32.56 ±7.84*t值 3.44 3.47 5.39 6.12 5.10 11.95 23.16 25.12 15.43

表2 大鼠海馬區(qū)Homer1a蛋白表達(dá)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)比較(±s，n=3)Table 2 Comparison of the Homer1a protein expression in hippocampus(±s，n=3)

表2 大鼠海馬區(qū)Homer1a蛋白表達(dá)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)比較(±s，n=3)Table 2 Comparison of the Homer1a protein expression in hippocampus(±s，n=3)

與對(duì)照組比較，*P ＜0.05

組別 各時(shí)間點(diǎn)Homer1a蛋白表達(dá)各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)1h 6h 24h 48h 72h對(duì)照組 0.011±0.019 0.010±0.009 0.011±0.010 0.010±0.010 0.010±0.010 1.86±0.20 1.90±0.20 1.85±1h 6h 24h 48h 72h 0.22 1.88±0.20 1.92±0.22 DBI組 0.136±0.024* 0.178±0.028* 0.176±0.027* 0.145±0.021* 0.117±0.012* 2.04±0.32 6.84±1.28* 13.78±2.40* 28.56±3.75* 41.78±3.96*t值 15.82 22.12 22.19 22.48 26.53 1.85 14.77 19.1727.52 38.92

2.4 相關(guān)分析結(jié)果 相關(guān)分析顯示1～24h Homer1a蛋白表達(dá)與存活神經(jīng)細(xì)胞百分率呈負(fù)相關(guān)(r=-0.726，P ＜0.05)，24 ～72h Homer1a 蛋白表達(dá)與存活神經(jīng)細(xì)胞百分率呈正相關(guān)(r=0.842，P ＜0.05);1～24h Homer1a蛋白表達(dá)與TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)(r=0.738，P ＜0.05)，24 ～72 h Homer1a蛋白表達(dá)與TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.898，P ＜0.05)。

3 討 論

顱腦創(chuàng)傷可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的壞死和凋亡。研究認(rèn)為相對(duì)于重型腦損傷，輕型顱腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞更傾向于凋亡［7］。本研究應(yīng)用HE染色觀察海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞病理形態(tài)變化，并動(dòng)態(tài)分析了存活神經(jīng)細(xì)胞百分率及凋亡神經(jīng)細(xì)胞情況，結(jié)果顯示重型DBI后海馬區(qū)早期(24 h內(nèi))存活神經(jīng)細(xì)胞百分率顯著降低，6 h和24 h可檢測(cè)到凋亡神經(jīng)細(xì)胞，雖然高于對(duì)照組，但凋亡率在10%左右，而到傷后72 h凋亡率在40%多，說明重型DBI早期神經(jīng)細(xì)胞丟失以神經(jīng)細(xì)胞壞死為主，后期神經(jīng)細(xì)胞凋亡逐漸占主導(dǎo)地位。本研究采用Marmarou's法建立的重型DBI模型，打擊的直接暴力、蛛網(wǎng)膜下腔出血及血塊、組織水腫等壓迫引起微血管斷裂塌陷、閉塞，造成微血循環(huán)斷流，甚至造成“缺血區(qū)”［8］;繼發(fā)的彌漫性腦腫脹、腦組織缺血缺氧導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)Homer1a的誘導(dǎo)激活可由神經(jīng)元興奮性活動(dòng)導(dǎo)出［9-10］。Homer1a激活后的主要作用包括:①選擇性阻斷Homerlb/c與代謝型谷氨酸受體的結(jié)合，調(diào)節(jié)代謝型谷氨酸在突觸部位的分布及受體信號(hào)傳遞效率，防止細(xì)胞過度興奮［11］;②減少N-甲基-M-天冬氨酸受體聚合物數(shù)量及膜表面α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體水平，減輕鈣離子超載［12］;③和其他信號(hào)如絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)交互作用，調(diào)節(jié)受損細(xì)胞的凋亡［13］。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為Homer1a表達(dá)上調(diào)對(duì)腦損傷有保護(hù)作用［5］。本研究結(jié)果顯示重型DBI后海馬區(qū)Homer1a與神經(jīng)細(xì)胞丟失存在一定內(nèi)在聯(lián)系，表現(xiàn)為Homer1a傷后1 h表達(dá)增多，6 h達(dá)峰值，高表達(dá)狀態(tài)持續(xù)至24 h，此階段存活神經(jīng)細(xì)胞百分率波動(dòng)在80%左右，48h和72h持續(xù)下降，存活神經(jīng)細(xì)胞率迅速下降、神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著的波動(dòng)并增加。我們認(rèn)為DBI早期誘導(dǎo)的Homer1a短期增多，可增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞對(duì)增多鈣離子的調(diào)控能力，因而此階段大部分神經(jīng)細(xì)胞存活狀態(tài);但增多Homer1a不足以對(duì)抗鈣超載帶來的神經(jīng)損傷，特別是在較為嚴(yán)重的顱腦創(chuàng)傷時(shí)，即使在Homer1a表達(dá)較多時(shí)，亦會(huì)出現(xiàn)較為明顯的死亡的神經(jīng)細(xì)胞;隨創(chuàng)傷時(shí)間的延長，Homer1a下降，鈣超載以及由此啟動(dòng)其他損傷因素的疊加作用，導(dǎo)致創(chuàng)傷24 h后大量細(xì)胞凋亡［14］。本研究的相關(guān)分析結(jié)果也說明重型DBI后Homer1a動(dòng)態(tài)表達(dá)在一定程度上反映了神經(jīng)細(xì)胞的丟失。DBI后Homer1a表達(dá)與神經(jīng)細(xì)胞死亡特別是凋亡的關(guān)系及機(jī)制尚需深入研究。

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