張秀梅，顧金松，劉 曙，石 明，蘇建軍

0 引 言

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是老年男性最常見的惡性腫瘤，位列男性常見腫瘤的第2位［1］。近年來，由于人口老齡化及生活習(xí)慣的改變，PCa的發(fā)病率呈逐年增高的趨勢，PCa病死率居高不下的主要原因在于術(shù)后易復(fù)發(fā)及向周圍組織浸潤轉(zhuǎn)移。血管內(nèi)皮生長因子-C(vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C)又稱淋巴管生長因子，是調(diào)節(jié)淋巴管生成作用的細胞因子，在低氧誘導(dǎo)下對新生血管的形成發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用，同時可以通過激活VEGF受體調(diào)節(jié)腫瘤組織的新生淋巴管形成并侵襲淋巴系統(tǒng)，這都可能與PCa的生長轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究采用TaqMan探針法RT-PCR技術(shù)檢測VEGF-C mRNA在前列腺癌細胞系、前列腺癌組織及前列腺增生組織中的表達，探討其臨床病理意義及與預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 細胞株與組織樣本 PCa細胞株DU145、PC-3、LNCap購自上海細胞庫，前兩者均為雄激素非依賴性、LNCap為雄激素依賴性。所有組織標(biāo)本均取自我院2007年8月至2012年5月根治性前列腺切除術(shù)、經(jīng)尿道前列腺電切術(shù)的患者，包括PCa患者32例，年齡54～78歲，平均年齡(67.2 ±5.3)歲，其中 Gleason評分2～6分7例，7～10分25例;良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia，BPH)患者15例，年齡53～73歲，平均年齡(63.5±4.8)歲。32份 PCa標(biāo)本和15份BPH標(biāo)本離體后盡快切取組織塊，裝入EP管并立即放入液氮中保存，然后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱內(nèi)保存。所有病例術(shù)前均未行放、化療或抗雄激素治療，所取樣本新鮮組織均獲得患者知情同意，并獲得醫(yī)院倫理委員會批準，所有病理診斷均由2位病理醫(yī)師雙盲復(fù)核證實。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 在含10%胎牛血清的RPM1640細胞培養(yǎng)基中加青霉素100 U/mL及鏈霉素100 U/mL，將 DU145、PC3、LNCap細胞接種于配好的培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2及95%飽和濕度條件下培養(yǎng)，用0.25%的胰蛋白酶消化，以離心半徑8 cm、1000 r/min離心5 min獲取細胞沉淀。

1.2.2 引物的設(shè)計與合成 根據(jù) GenBank人類VEGF-C和GAPDH基因mRNA序列(登錄號:NM_005429和NM_005631)，設(shè)計引物序列如下:VEGF-C上游引物 5'AAGATcCGCAGACGTGTAAATGTT3'，下游引物5'CGGCTTGTCACATGCAAGT3';片段長度121 bp。以3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內(nèi)參基因，其上游引物5'CATGGGTGTGAACCATGAGAAGTA3'，下游引物5'GACTGTGGTCATGAGTCCTTCC3';片段長度138 bp，探針FAM(熒光基團)5'CATGCCATCACTGCCACCCAGAAG3'TAMRA(淬滅熒光基團)。所有引物均委托Invitrogen(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.2.3 RNA提取 取PCa細胞沉淀和新鮮組織分別加入液氮預(yù)冷的勻漿儀進行勻漿30 s，再加入含有預(yù)冷1 mL Trizol提取液的15 mL離心管中，搖勻靜置10 min;加0.2 mL酚氯仿混勻、離心、取上清，異丙醇沉淀，75%冷乙醇洗滌。

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及熒光定量PCR 預(yù)變性，65℃5 min，逆轉(zhuǎn)錄42℃ 10min，95℃ 45s，-20℃保存?zhèn)溆谩CR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min，95℃變性5s，58℃退火45s，72℃延伸45s，共計40 個循環(huán)，所有反應(yīng)重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理 實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用2-ΔΔCt進行處理，根據(jù)實時熒光定量PCR中Ct值和樣本起始拷貝數(shù)的對應(yīng)關(guān)系，各樣本目的基因VEGF-C的Ct值減去內(nèi)參基因GAPDH的Ct值得到該樣本的ΔCt值，計算各樣本的2-ΔCt值，以2-ΔΔCt值代表 VEGF-C mRNA表達的相對量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差(±s)表示，兩組均數(shù)間的比較采用兩獨立樣本t檢驗，VEGF-C mRNA的表達與臨床病理參數(shù)之間的多組均數(shù)的比較在滿足方差齊性時應(yīng)用單因素方差分析，方差不齊時應(yīng)用非參數(shù)檢驗Mann-Whitney U檢驗，組間的生存情況應(yīng)用Log-Rank檢驗，Kaplan-Meier法繪制生存曲線，以P≤0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 VEGF-C mRNA在 PCa細胞系中的表達VEGF-C mRNA在PC-3細胞系和在DU145細胞呈高表達，相對表達量分別為 153.31 ±26.24、194.62 ±41.36，在 LNCap細胞中呈低表達，相對表達量為1.00 ±0.00。

2.2 VEGF-C mRNA在PCa組織中的表達 32份PCa組織中VEGF-C mRNA的表達量(13.67±1.95)較15 份 BPH 組織(11.89 ±1.63)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004)。見表1。

2.3 PCa組織中VEGF-C mRNA的表達與臨床病理參數(shù)的比較 VEGF-C mRNA的高表達與高Gleason評分及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。其中Gleason評分＞7分組中較Gleason評分≤7分組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004)，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的表達顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.015)。VEGF-C mRNA的相對表達量與年齡及PSA值無相關(guān)性(P=0.138;P=0.083)。見表1。

表1 前列腺癌組織中VEGF-C mRNA的表達與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性(±s)Table 1 Relationship between VEGF-C mRNA expression in PCa and clinicopathological parameters(±s)

表1 前列腺癌組織中VEGF-C mRNA的表達與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性(±s)Table 1 Relationship between VEGF-C mRNA expression in PCa and clinicopathological parameters(±s)

項目 n VEGF-C mRNA P值年齡(歲)≤60＞60 11 21 13.30 ±1.43 14.39 ±2.61 0.138 Gleason評分≤7分＞7分7 25 13.16 ±1.95 15.48 ±1.79 0.004 PSA值≤20 μg/L＞20 μg/L 13 19 13.18 ±1.41 14.49 ±2.43 0.083淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有無18 14 14.39 ±1.77 12.74 ±1.810.015

2.4 VEGF-C mRNA的表達與PCa患者預(yù)后的關(guān)系本組32例PCa患者中，獲得隨訪21例，隨訪時間為4～41個月，進行單因素的預(yù)后分析，將本組病例分為VEGF-C mRNA高表達者(2-ΔΔCt＞2)16例和低表達者(2-ΔΔCt≤2)5 例，3 年累積生存率分別為 12.5% 和40.0%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.033)，見圖1。

圖1 VEGF-C mRNA不同表達者與患者生存時間比較Figure 1 Relation between VEGF-C mRNA expression and the survival time of patients with PCa

3 討 論

PCa是男性最常見的惡性腫瘤之一，尋找早期發(fā)現(xiàn)前列腺癌的腫瘤標(biāo)記物成為降低死亡率的關(guān)鍵［2］。

VEGF是目前研究證實調(diào)節(jié)腫瘤血管生成最主要的一組因子［3］。人類VEGF-C基因定位于染色體4q34，是促進淋巴管新生的關(guān)鍵因子，可通過結(jié)合并激活淋巴內(nèi)皮細胞表面的受體VEGFR-3，促進淋巴內(nèi)皮細胞的增殖、存活與遷移，調(diào)節(jié)腫瘤血管新生和淋巴管生成，促進腫瘤細胞進入淋巴管，通過淋巴系統(tǒng)向全身轉(zhuǎn)移和擴散［4-5］。

成人的VEGF-C作為特異性淋巴管內(nèi)皮細胞的生長因子，在淋巴結(jié)、胎盤、卵巢、心臟、小腸及骨骼肌中都有弱表達［6］。研究證實，VEGF-C在非小細胞肺癌、甲狀腺癌、食管癌、大腸癌、胃癌、黑色素瘤及乳腺癌中表達均明顯增高，且與腫瘤的病理分級和預(yù)后相關(guān)［7］。Furudoi等［8］對 152 例進展期結(jié)直腸癌研究表明，VEGF-C蛋白與淋巴管和脈管侵犯、Dukes分期、肝轉(zhuǎn)移、浸潤深度、分化程度和微血管密度相關(guān)，是影響5年生存率的獨立預(yù)后因素。Feng等［9］利用siRNA沉默VEGF-C基因的方法抑制VEGF-C的表達，發(fā)現(xiàn)非小細胞肺癌的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移受到明顯抑制。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)VEGF-C mRNA在PC-3和DU145細胞中的表達量較LNCap細胞中顯著增高。LNcap細胞系代表著早期非轉(zhuǎn)移、雄激素依賴的PCa的顯著特征，其本身具有成瘤性差、轉(zhuǎn)移力相對較低的特點，而PC3和DU145細胞系內(nèi)具有較強的遷移、侵襲能力和體內(nèi)成瘤能力，這提示在轉(zhuǎn)錄水平上，VEGF-C在促進PCa細胞系轉(zhuǎn)移侵襲方面起一定的作用。在PCa組織標(biāo)本中，VEGF-C mRNA的高表達更易出現(xiàn)在高Gleason評分及有淋巴轉(zhuǎn)移的患者，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)可能是由于腫瘤的基質(zhì)細胞分泌VEGF-C，進而通過誘導(dǎo)淋巴管新生并分泌淋巴相關(guān)趨化因子等促進淋巴管的轉(zhuǎn)移，Tsurusakl等［10］應(yīng)用原位雜交方法研究VEGF-C在PCa組織中的表達，結(jié)果顯示PCa中VEGF-C的表達和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，所有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例均呈VEGF-C陽性表達，而且非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中只有約40%的標(biāo)本呈陽性表達，與我們的研究結(jié)果一致。Gleason評分及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移被認為是評價PCa預(yù)后及進展最重要的指標(biāo)之一［11］，因此推測VEGF-C有可能成為評估PCa的生物學(xué)行為和判斷預(yù)后的有效參考指標(biāo)。我們尚未觀察到VEGF-C與患者血清PSA水平存在明顯相關(guān)，這可能與不同患者血清PSA變異度較大有關(guān)。Shimizu等［12］用VEGF-C單克隆抗體來抑制VEGF-C的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VEGF-C表達高的腫瘤組織內(nèi)和腫瘤周邊新生淋巴管明顯減少，抑制了腫瘤組織向淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移。這種抗淋巴管形成的靶向治療為腫瘤的治療提供了嶄新的思路。

總之，本研究應(yīng)用RT-PCR發(fā)現(xiàn)了VEGF-C mRNA在PC3和DU145細胞系高表達，在PCa中高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高Gleason評分均呈正相關(guān)，且高表達患者預(yù)后更差，提示VEGF-C有可能成為判斷PCa侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的新標(biāo)志及基因治療的新靶點。

［1］ 王永川，魏麗娟，劉俊田，等.發(fā)達與發(fā)展中國家癌癥發(fā)病率與死亡率的比較與分析［J］.中國腫瘤臨床，2012(10):679-682.

［2］ 韓蘇軍，張思維，陳萬青，等.中國前列腺癌發(fā)病現(xiàn)狀和流行趨勢分析［J］.臨床腫瘤學(xué)雜志，2013，18(4):330-334.

［3］ 韓曼麗，章金春.雷公藤多苷對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠組織中血管內(nèi)皮生長因子及血管內(nèi)皮生長因子受體2mRNA表達水平的影響［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2013，26(5):478-480.

［4］ 吳雪芹，岑 洪，譚曉虹，等.VEGF-C基因沉默對裸鼠移植乳腺癌淋巴管和血管生成影響的觀察［J］.中華腫瘤防治雜志，2013，20(8):583-587.

［5］ 王允芬，姚艷雯，劉紅兵，等.伊曲康唑?qū)ewis肺癌荷瘤裸鼠惡性胸腔積液生成的抑制作用［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2014，27(1):19-22.

［6］ Lynch TJ，Bell DW，Sordella R，et al.Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib［J］.N Engl J Med，2004，350(21):2129-2139.

［7］ 唐月汀，焦曉陽.血管內(nèi)皮生長因子C在惡性腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用與臨床研究［J］.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2012(3):176-178.

［8］ Furudoi A，Tanaka S，Haruma K，et al.Clinical significance of vascular endothelial growth factor C expression and angiogenesis at the deepest invasive site of advanced colorectal carcinoma［J］.Oncology，2002，62(2):157-166.

［9］ Feng Y，Hu J，Ma J，et al.RNAi-mediated silencing of VEGFC inhibits non-small cell lung cancer progression by simultaneously down-regulating the CXCR4，CCR7，VEGFR-2 and VEGFR-3-dependent axes-induced ERK，p38 and AKT signalling pathways［J］.Eur J Cancer，2011，47(15):2353-2363.

［10］ Tsurusaki T，Kanda S，Sakai H，et al.Vascular endothelial growth factor-C expression in human prostatic carcinoma and its relationship to lymph node metastasis［J］.Br J Cancer，1999，80(1-2):309-313.

［11］ 程 亮，饒 秋，黃文斌.前列腺癌的病理分期進展［J］.中華病理學(xué)雜志，2013，42(5):351-354.

［12］ Shimizu K，Kubo H，Yamaguchi K，et al.Suppression of VEGFR-3 signaling inhibits lymph node metastasis in gastric cancer［J］.Cancer Sci，2004，95(4):328-333.