張建波，王莉莉，張媛媛，李文全

(1青州市人民醫(yī)院，山東青州262500;2益都中心醫(yī)院)

甘露糖高表達(dá)是腫瘤細(xì)胞的重要特征之一，目前臨床已將甘露糖作為腫瘤治療的一個重要靶點(diǎn)。甘露糖敏感型綠膿桿菌制劑(PA-MSHA)為一種新型免疫抑制劑，研究發(fā)現(xiàn)其能與甘露糖發(fā)生特異性結(jié)合并作用于腫瘤細(xì)胞［1］，對誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡和抑制其轉(zhuǎn)移具有明顯優(yōu)勢但其對于肝癌細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響報道較少。2013年5～12月，我們觀察了PA-MSHA對肝癌細(xì)胞增殖的影響，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細(xì)胞株HepG2、MHCC97L(復(fù)旦大學(xué)研究所所提供)。DMEM培養(yǎng)基(北京索萊寶科技有限公司提供)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供)，免疫人Cyclin D1、PCNA和CDK2以及p21與p27單克隆抗體(美國 Neomarkers公司提供)，甘露糖敏感型綠膿桿菌制劑(北京萬特爾生物制藥有限公司提供)，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀器(美國BD公司提供)、FR-200A全自動紫外裝置(上?；輧|生物科技有限公司提供)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù) 選取肝癌細(xì)胞株 MHCC97L及HepG2分別于DMEM培養(yǎng)基中37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)孵育，每隔3天更換1次培養(yǎng)基;在0.25%胰酶—乙二胺四乙酸消化后予1∶3傳代處理［2］。細(xì)胞傳代過夜、貼壁進(jìn)入對數(shù)生長期后選取96孔板，每個孔板中加入100.0 μL的2 000個細(xì)胞。MHCC97L及HepG2均隨機(jī)分為對照組及觀察1組、觀察2組和觀察3組。對照組不干預(yù)，觀察1組予1.0×108/mL的PA-MSHA處理，觀察2組予2.0×108/mL的PA-MSHA處理，觀察3組予2.0×108/mL的PA-MSHA+100 mmol/L的甘露糖處理。

1.2.2 觀察項(xiàng)目

1.2.2.1 細(xì)胞增殖率 采取 MTT法。HepG2和MHCC97L干預(yù)后孵育培養(yǎng)48 h，每孔加入10.0 μL的 CCK-8 溶液;分別于干預(yù)1、2、3、4、5、6 h 測定450 nm處吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖率［3］。

1.2.2.2 細(xì)胞周期 分別取培養(yǎng)后濃度為1.0×105/mL的HepG2和 MHCC97L細(xì)胞6.0 mL置于50.0 mL的培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁之后吸出培養(yǎng)液，按1.2.1分組及加藥。藥物作用72 h后消化收集細(xì)胞，離心、洗滌，調(diào)整濃度為1.0×106/mL;于-20℃環(huán)境下予70.0%乙醇行固定24 h;離心去掉固定液后PBS清洗1次，加入碘化丙啶液50.0 μL，于4℃環(huán)境下避光處理340 min。FACSCalibur流式細(xì)胞儀器檢測、分析細(xì)胞周期［4］。

1.2.2.3 細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá) HepG2和MHCC97L均先于封閉液室溫條件下封閉轉(zhuǎn)移后的PVDF膜1 h，放入雜交袋中，加入一抗稀釋，反應(yīng)1 h后置入4℃冰箱處理24 h;PBST洗滌PVDF膜3次，每次15 min;加入二抗處理30 min，PBST洗滌PVDF膜4次，每次15 min;將PVDF膜置入等量混合ECL中的A、B 液中，孵育 5 min，于暗室中曝光顯影觀察［5］，測定藥物干預(yù)前后細(xì)胞細(xì)胞周期蛋白(CyclinD1)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)和周期蛋白激酶2(CDK2)以及p21與p27表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料采用±s表示，獨(dú)立樣本比較采取t檢驗(yàn)，頻數(shù)之間比較采取χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖率 HepG2和MHCC97L的觀察1組、觀察2組細(xì)胞增殖率均明顯低于對照組(P＜0.05)，且呈劑量及時間依賴性(P ＜0.05);觀察3組與對照組比較無明顯變化。見表1、表2。

表1 MHCC97L細(xì)胞干預(yù)后不同時間細(xì)胞增殖率比較

表2 HepG2細(xì)胞干預(yù)后不同時間細(xì)胞增殖率比較

2.2 細(xì)胞周期 HepG2和MHCC97L組細(xì)胞周期變化見表3、表4。觀察1組、觀察2組細(xì)胞周期阻滯明顯強(qiáng)于對照組，且呈劑量及時間依賴性(P＜0.05);觀察3組與對照組比較無明顯變化，說明PA-MSHA對肝癌細(xì)胞周期有明顯的抑制作用。

表3 MHCC97L細(xì)胞周期比例(%)

表4 HepG2細(xì)胞周期比例(%)

2.3 相關(guān)蛋白表達(dá) HepG2和MHCC97L各觀察組Cyclin D1、PCNA和CDK2表達(dá)均明顯低于對照組，p21與p27蛋白表達(dá)均明顯高于對照組(P均＜0.05)。見圖1。

3 討論

肝癌細(xì)胞惡化的過程中經(jīng)常伴隨著比較復(fù)雜的細(xì)胞表面糖蛋白變化，常見的有甘露糖和唾液酸。相關(guān)研究顯示，乳腺癌、頭頸部癌及肝癌細(xì)胞均存在高含量的甘露糖，主要原因?yàn)楦事短遣荒軌蛴行У脑谀[瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)化［6］。

圖1 各組 Cyclin D1、PCNA、CDK2及p21、p27 蛋白表達(dá)

研究發(fā)現(xiàn)，PA-MSHA對肝癌細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期均具有明顯的抑制作用［7］;而外源性甘露糖能夠阻止其抑制作用;進(jìn)一步說明其細(xì)胞的毒作用主要是由甘露糖介導(dǎo)的;研究顯示，無論是小劑量還是大劑量PA-MSHA均對肝癌細(xì)胞的生長周期和增殖有明顯抑制作用［8］。本研究結(jié)果顯示，HepG2和MHCC97L的觀察1組及觀察2組PA-MSHA作用后細(xì)胞多數(shù)停留在G0～G1期和G2～M期，S期的增殖細(xì)胞明顯減少，且細(xì)胞增殖速率也大大降低;而觀察3組(PA-MSHA+甘露糖)細(xì)胞周期和增殖抑制并不明顯。進(jìn)一步分析，不同肝癌細(xì)胞中應(yīng)用甘露糖均對其具有抑制周期和增增殖的作用;本研究應(yīng)用PA-MSHA的三組Cyclin D1、PCNA和CDK2表達(dá)均明顯降低，p21與p27蛋白表達(dá)均明顯升高。主要是由于Cyclin D1是肝癌細(xì)胞G1期向S期轉(zhuǎn)變的正常因子，且是G1期的常見蛋白，由于細(xì)胞周期抑制，從而使得Cyclin D1蛋白降低;PCNA和CDK2亦為G1周期中的常見蛋白，由于G1周期被抑制，促使其含量降低。p21與p27均是細(xì)胞周期的負(fù)向調(diào)節(jié)因子，由于細(xì)胞處于G0～G1期和G2～M期時其含量異常增加，從而抑制Rb蛋白的磷酸化，使得細(xì)胞周期阻滯［9］。

綜上所述，PA-MSHA對HepG2和MHCC97L增殖均具有抑制作用，其主要作用機(jī)制可能為抑制Cyclin D1、PCNA和CDK2表達(dá)，促進(jìn)p21與p27表達(dá)。PA-MSHA的應(yīng)用可為肝癌的治療提供新方向。

［1］李濤，湯釗猷，周建煒，等.甘露糖敏感性綠膿桿菌制劑誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌凋亡的機(jī)制研究［J］.中華肝膽外科雜志，2011，17(10):838-841.

［2］呂國悅，陳儇，邱偉，等.受體作用蛋白在肝癌細(xì)胞對腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體誘導(dǎo)凋亡耐受中的作用［J］.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2011，28(10):1649-1652.

［3］Taylor PD，Wilson H，Hillier SG，et al.Effects of inhibition of vascular endothelial growth factor at time of selection on follicular angiogenesis，expansion，development and atresia in the marmoset［J］.Mol Hum Reprod，2007 ，13(10):729-736.

［4］周建煒，黃修燕，居旻杰，等.綠膿桿菌制劑對人肝癌MHCC97L細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響［J］.中華肝膽外科雜志，2010，16(6):455-459.

［5］Yamanaka Y，Shiraki K，Inoue T，et al.COX-2inhibitors sensitize human hepatocellular carcinoma cells to TRAIL-induced apoptosis［J］.Int J Mol Med，2006 ，18(1):41-47.

［6］李濤，薛瓊，周建瑋，等.綠膿桿菌制劑抑制肝細(xì)胞肝癌生長轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華肝膽外科雜志，2009，15(11):848-850.

［7］呂國悅，張強(qiáng)，李航，等.腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體與肝癌細(xì)胞凋亡［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2008，34(1):167-170.

［8］Yang G，Chu W，Zhang H，et al.Isolation and identification of mannose-binding proteins and estimation of their abundance in sera fromhepatocellular carcinoma patients［J］.Proteomics，2013，13(5):878-892.

［9］郭忠義，董兆如，智緒亭，等.甘露糖敏感型綠膿桿菌制劑對肝癌細(xì)胞周期的作用機(jī)制研究［J］.中華肝膽外科雜志，2013，19(6):452-455.