毛瑩瑩，王東強(qiáng)，李志軍

(1天津醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院，天津300070;2天津市第一中心醫(yī)院)

膿毒癥屬于多基因疾病，可通過一系列復(fù)雜且逐級(jí)放大的全身炎癥反應(yīng)造成機(jī)體重要臟器的損傷，其中肝臟是膿毒癥時(shí)最易受損的器官之一［1］。傳統(tǒng)的檢測方法不僅費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，而且很難明確多基因的表達(dá)變化及其相互作用關(guān)系，而應(yīng)用基因芯片技術(shù)則彌補(bǔ)了上述不足，為探討膿毒癥的分子機(jī)制提供了強(qiáng)有力的工具?；蛐酒菍⒃S多特定的基因片段作為探針有規(guī)律地排列于固相載體上，將合成aRNA經(jīng)熒光標(biāo)記后與其雜交，以計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行檢測分析，從而同時(shí)反映上千個(gè)基因的表達(dá)狀況［2］。2013年10月～2014年5月，我們通過盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)復(fù)制膿毒癥大鼠模型，采用基因芯片技術(shù)通過大量寡核苷酸探針大規(guī)模地檢測樣品的基因序列及表達(dá)信息，從基因水平揭示膿毒癥的發(fā)病機(jī)制，為尋求新的治療手段提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 Wistar大鼠，雄性，120只，清潔級(jí)，8～10周齡，體質(zhì)量(250±10)g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心統(tǒng)一提供，并適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。5%的水合氯醛。分析天平(Mettler AE240)，超純水系統(tǒng)(Millipore Milli-Q)，小動(dòng)物手術(shù)床(Py2-501213)，18 G穿刺針，注射器，皮針，4-0非吸收性外科縫線。美國Affymetrix大鼠全基因表達(dá)譜芯片(Rat Genome 230 2.0)，含有28 000個(gè)大鼠基因cDNA克隆，由天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司提供。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模 將120只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組30只、模型組90只，假手術(shù)組和模型組根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)(24、48、72 h)再隨機(jī)分為3個(gè)亞組，每個(gè)亞組分別為10、30只。實(shí)驗(yàn)前禁食過夜，自由飲水。按照改良 CLP［3～5］復(fù)制嚴(yán)重腹腔感染致膿毒癥模型。假手術(shù)組開腹翻動(dòng)盲腸后關(guān)腹。觀察各組大鼠的一般狀況。

1.2.2 基因芯片的檢測 兩組分別于造模后24、48、72 h，無菌條件下取各亞組存活大鼠肝臟組織，速置于液氮中，-70℃保存待檢。采用大鼠全基因表達(dá)譜芯片檢測兩組肝組織中的差異表達(dá)基因，并對(duì)這些基因按其所編碼的蛋白質(zhì)功能予以聚類分析。操作流程:①總RNA的提取和純化:用Trizol試劑盒抽提液氮中肝組織總RNA，紫外吸收測定法和變性膠電泳法確認(rèn)RNA純度及完整性。②反轉(zhuǎn)錄并標(biāo)記探針:利用T7-(dT)24作為引物，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，由RNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，再以所合成的單鏈cDNA為模板，RNA片段為引物，在DNA聚合酶的作用下合成雙鏈DNA，并兩端補(bǔ)平。利用反轉(zhuǎn)錄過程中所加入的T7啟動(dòng)子，在體系中加入T7轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，并同時(shí)對(duì)產(chǎn)生的aRNA產(chǎn)物進(jìn)行Biotin標(biāo)記。③芯片雜交:與Rat Genome 230 2.0芯片雜交。④洗脫芯片:在洗滌工作站FS450上按照芯片類型，運(yùn)行洗脫程序，對(duì)芯片進(jìn)行清洗、染色和信號(hào)放大過程。⑤掃描芯片:用Scanner 3000 7G 4C掃描儀上芯片對(duì)芯片進(jìn)行掃描和信號(hào)值轉(zhuǎn)換(將探針信號(hào)比的值做以2為底的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，正值為上調(diào)，負(fù)值為下調(diào))。⑥差異基因的篩選:模型組/對(duì)照組倍數(shù)變化大于2或小于-2可認(rèn)為基因的表達(dá)存在差異，且絕對(duì)值越大，基因表達(dá)差異越明顯。正值代表基因表達(dá)上調(diào)，負(fù)值代表基因表達(dá)下調(diào)。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般狀況觀察 假手術(shù)組大鼠術(shù)后30 min左右完全蘇醒，因腹部疼痛而活動(dòng)減少，不時(shí)舔舐傷口，但數(shù)小時(shí)后明顯好轉(zhuǎn)，飲食飲水正常。模型組術(shù)后24 h內(nèi)，部分死亡，存活者軀體蜷縮，呼吸頻率較快，精神萎靡，眼目不睜，不進(jìn)食水，對(duì)刺激反應(yīng)遲鈍;24 h后精神狀態(tài)較前好轉(zhuǎn)，有少量活動(dòng)，少量進(jìn)食飲水。隨著時(shí)間的延長，多數(shù)大鼠眼周出現(xiàn)血性分泌物，排泄稀水樣便，色黃、味腥臭，多數(shù)病情進(jìn)一步發(fā)展，皮膚松弛，肛溫低，排泄物呈黏液狀、量多，出現(xiàn)上述癥狀后短時(shí)間內(nèi)死亡;另有少數(shù)大鼠出現(xiàn)腹瀉后又停止，進(jìn)食、飲水量逐漸增加，活動(dòng)逐漸增多。

2.2 兩組肝臟組織中基因表達(dá)譜差異 造模24 h，篩選出差異基因671條，免疫相關(guān)基因97條(表達(dá)上調(diào)48條、下調(diào)49條);造模48 h，篩選出差異基因133條，免疫相關(guān)基因36條(表達(dá)上調(diào)13條、下調(diào)23條);造模72 h，篩選出差異基因204條，免疫相關(guān)基因33條(表達(dá)上調(diào)18條、下調(diào)15條)。3個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)基因共58條，免疫相關(guān)基因15條(表達(dá)上調(diào)4條、下調(diào)10條、先上調(diào)后上調(diào)1條)。兩組差異表達(dá)的部分免疫相關(guān)基因，見表1。

3 討論

CLP模型是研究膿毒癥較理想的模型，被認(rèn)為是進(jìn)行膿毒癥研究的金標(biāo)準(zhǔn)［6～7］。它是由盲腸結(jié)扎加穿孔致嚴(yán)重腹膜炎，動(dòng)物能存活5～10 d，保持了感染源的持續(xù)存在，通過少量持續(xù)的細(xì)菌及腸內(nèi)容物釋放，保證了促炎/抗炎反應(yīng)的充分發(fā)展，形成了符合高代謝、高排低阻和全身炎癥反應(yīng)等臨床癥狀的膿毒癥模型。本實(shí)驗(yàn)中觀察到術(shù)后動(dòng)物活動(dòng)減少，被毛蓬松少光澤，排泄稀水樣便、色黃、味腥臭，膿尿，眼周出現(xiàn)血性分泌，瀕死前可出現(xiàn)呼吸困難，對(duì)被動(dòng)仰臥無反抗等;尸解見腹腔有渾濁滲出液，空腔充氣甚至壞疽，盲腸腫脹、粘連，穿刺部位引流條明顯，肝、腎充血等。CLP模型制備較成功。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥大鼠肝組織中，一系列與細(xì)胞防御及免疫功能相關(guān)的基因表達(dá)出現(xiàn)顯著改變，它們可能在不同程度上參與了膿毒癥大鼠肝損傷的病理生理過程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，膿毒癥時(shí)脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)基因表達(dá)上調(diào)。其表達(dá)產(chǎn)物屬脂質(zhì)結(jié)合血清糖蛋白家族，主要功能是識(shí)別及結(jié)合LPS的脂質(zhì)A基團(tuán)，并與細(xì)胞膜上或血清中的CD14分子形成復(fù)合物，通過跨膜的共刺激分子Toll樣受體(TLRs)和細(xì)胞內(nèi)的MAPK蛋白激酶信息傳導(dǎo)途徑，激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB等，啟動(dòng)炎性和免疫反應(yīng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄［8～11］。增加的 LBP可使細(xì)胞對(duì)LPS或革蘭陰性細(xì)菌的敏感性升高，進(jìn)而增強(qiáng)免疫和炎性反應(yīng)。另外，本實(shí)驗(yàn)中IL-1受體拮抗劑(IL-1RN)表達(dá)上調(diào)。IL-1是在炎癥因子的刺激下所誘導(dǎo)產(chǎn)生的，它主要介導(dǎo)一系列炎癥和免疫反應(yīng)中(IL-1可激活T、B淋巴細(xì)胞)所發(fā)生的病理、生理學(xué)反應(yīng)。IL-1RN可與IL-1競爭性結(jié)合而抑制IL-1的生物活性。IL-1及其受體在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)平衡是維持IL-1正常功能的關(guān)鍵。IL-1RN的高低可反映IL-1在膿毒癥中的致病作用，其表達(dá)上調(diào)則抑制IL-1的生物活性，在一定程度上可抑制IL-1對(duì)T、B淋巴細(xì)胞的激活作用，抑制機(jī)體的免疫功能。

表1 兩組差異表達(dá)的部分免疫相關(guān)基因

本研究發(fā)現(xiàn)，免疫系統(tǒng)重要調(diào)節(jié)細(xì)胞T細(xì)胞功能失調(diào)。膿毒癥狀態(tài)下，淋巴細(xì)胞大量凋亡所致淋巴細(xì)胞數(shù)目減少是造成機(jī)體免疫抑制狀態(tài)的重要原因，表現(xiàn)為非成熟及成熟淋巴細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。雖然淋巴細(xì)胞對(duì)外界刺激異常敏感是細(xì)胞自身的一種保護(hù)機(jī)制，但是未成熟T細(xì)胞大量凋亡勢必引起釋放至外周淋巴器官中的成熟淋巴細(xì)胞減少，直接和間接損害免疫功能，最終將導(dǎo)致免疫低下狀態(tài)，該效應(yīng)以T細(xì)胞功能抑制尤為突出。這與李志軍等［12］的研究一致。本實(shí)驗(yàn)中，膿毒癥時(shí)S100A8基因表達(dá)升高。其表達(dá)產(chǎn)物屬S100小分子量蛋白家族，主要功能是與鈣離子結(jié)合，可與多不飽和脂肪酸如花生四烯酸等炎癥介質(zhì)結(jié)合，并將其轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外，加劇炎癥反應(yīng)［13］;該反應(yīng)過程中TNF-α或IL-1又可使S100A8基因高表達(dá)，對(duì)膿毒癥的發(fā)展可能起到正反饋?zhàn)饔茫?］。

本實(shí)驗(yàn)中，模型組α2M表達(dá)顯著升高。α2M是一種蛋白酶抑制劑，能結(jié)合并清除某些過度表達(dá)的細(xì)胞因子［13］。膿毒癥時(shí)α2M升高，當(dāng)過度產(chǎn)生的炎癥因子回落近平衡狀態(tài)且局部微環(huán)境穩(wěn)定時(shí)，α2M反射性下調(diào)［14］。α2M表達(dá)升高為機(jī)體的一種自我保護(hù)機(jī)制。另外，膿毒癥發(fā)生時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生大量促炎介質(zhì)，如 IL-6、TNF-α、IFN-γ、HMGB1 等［15］，導(dǎo)致免疫平衡受到破壞。各種毒素侵襲使得淋巴細(xì)胞發(fā)生大量凋亡，免疫系統(tǒng)被廣泛抑制，導(dǎo)致病原菌不能及時(shí)被清除，感染進(jìn)一步惡化。本實(shí)驗(yàn)以基因芯片技術(shù)檢測到CLP膿毒癥的肝組織中免疫球蛋白重鏈表達(dá)量、聚合體的免疫球蛋白受體表達(dá)均下降，細(xì)胞免疫相關(guān)基因下調(diào)，炎癥趨化因子及抗炎相關(guān)基因上調(diào)，它們可能在膿毒癥及肝損傷的發(fā)病中起了一定的作用。

［1］劉勇，吳彼得，林建東，等.膿毒癥大鼠肝臟組織基因表達(dá)變化的研究［J］.中國急救醫(yī)學(xué)，2013，33(4):303-305.

［2］ Lockhart DJ，Winzeler EA.Genomics，gene expression and DNA arrays［J］.Nature，2000，405(6788):827-836.

［3］ Gurlich R，Kieslichova E，Merta D，et al.Caecal ligation and puncture in the minipig-a model of sepsis induction［J］.Cas Lek Cesk，2012，151(5):248-253.

［4］Baker CC，Chaudry IH，Gaines HO，et al.Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model［J］.Surgery，1983，94(2):331-335.

［5］Jankiewicz-Wika J，Kolomecki K，Cywinski J，et al.Impact of vertical banded gastroplasty on body weight，insulin resistance，adipocytokine，inflammation and metabolic syndrome markers in morbidly obese patients［J］.Endokrynologia Polska，2011，62(2):109-119.

［6］Lengacher S，Reed D，Heumarm D，et al.Genomic organization and chromosomal localization of the mouse lipopolysaccharide binding protein gene［J］.Immunogenetics，1999，49(6):553-556.

［7］ Haudek SB，Natmessnig BE，Redl H，et al.Isolation，partial characterization，and concentration in experimental sepsis of baboon lipopolysaccharide-binding protein［J］.J Lab Clin Med，2000，136(5):363-370.

［8］Ulevitch RJ，Tobias PS.Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system［J］.Curt Opin Immunol，1999，11(1):19-22.

［9］Chiba M，Mumta S，Mymnovych A，et al.Elevacion and chteristics of Rab30 and S100a8/S100a9 expmssion in an early phase of liver regeneration in the mouse［J］.Int J Mol Med，2011，27(4):567-574.

［10］ Webb DJ，Gonias SL.A modified human alpha 2-macroglobulin derivative that binds tumor necrosis factor-alpha and interleukin-1 beta with high affinity in vitro and reverses lipopolysaccharide toxicity in vivo in mice［J］.Lab Investig，1998，78(8):939-948.

［11］牟麗萍，田玉峰，王桂菊，等.哮喘急性發(fā)作期患兒血清MMP-2，MMP-9，α2-巨球蛋白的表達(dá)及意義［J］.山東醫(yī)藥，2008，48(28):51-52.

［12］李志軍，李銀平，蓋慧榮，等.血必凈注射液對(duì)膿毒癥大鼠基因調(diào)控的影響［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2007(4):43-46.

［13］Marton A，Kolozsi C，Kusz E，et al.Propylene-Glycol aggravates LPS-induced sepsis through production of TNF-α and IL-6［J］.I-ran J Immunol，2014，11(2):113-122.

［14］Ebong S，Call D，Nemzek J，et al.Immunopathologic alterations in murine models of sepsis of increasing severity［J］.Infect Immun，1999，67(12):6603-6610.

［15］Tavasoli S，Zarnani AH，Vafa M，et al.The effect of pomegranate extract on survival and peritoneal bacterial load in cecal ligation and perforation model of sepsis in rats［J］.Int J Prev Med，2014，5(1):104-109.