劉博，程樹(shù)杰

（河北大學(xué)，河北 保定 071000）

黃藥子為薯蕷科 （Dioscoreaceae）黃獨(dú)（Dioscorea bulbifera L）的塊莖[1]。黃藥子具有涼血、降火、消癭、解毒、化痰散結(jié)的功效，可用于治療多種疾病[2-4]，具有一定的毒性[5]，同時(shí)，近年來(lái)研究以黃藥子為主藥的中藥制劑可用于治療各種腫瘤[6]。隨著黃藥子藥理作用的研究，其抗腫瘤活性成分也受到了極大的關(guān)注[7]，其中黃獨(dú)乙素（Diosbulbin B）是黃藥子中所含的主要生物堿之一，在黃藥子抗腫瘤活性得到研究證實(shí)的同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)黃獨(dú)乙素對(duì)胃癌具有治療作用[8]。本研究實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較黃獨(dú)乙素對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞及其耐藥細(xì)胞株的增殖抑制效果，從而闡明黃獨(dú)乙素對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制作用是否受到該細(xì)胞株對(duì)其他化療藥物耐藥的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

黃獨(dú)乙素（四川省維克奇生物科技有限公司），注射用順鉑、5-FU、阿霉素，四甲基偶氮唑鹽（MTT）（美國(guó)sigma公司）。黃獨(dú)乙素溶解在DMSO中，濃度為800μmol/L，4℃保存；順鉑、5-FU、阿霉素溶解于DMSO中，濃度為400μmol/L，4℃保存，實(shí)驗(yàn)中用相應(yīng)的培養(yǎng)液或溶劑稀釋。人低分化胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901（河北大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供）。實(shí)驗(yàn)分為4個(gè)大組進(jìn)行，根據(jù)使用細(xì)胞株的不同分為SGC-7901細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)組、SGC-7901/順鉑細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)組、SGC-7901/5-FU細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)組、SGC-7901/阿霉素細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)組，根據(jù)黃獨(dú)乙素毒理作用[5]，四組均采用10μmol/L、20μ mol/L、40μ mol/L、80μ mol/L、160μmol/L濃度黃獨(dú)乙素處理，陰性對(duì)照組為不含黃獨(dú)乙素的等量DMSO，空白組為等量培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 胃癌耐藥細(xì)胞株的建立

選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入不同濃度的順鉑、5-FU、阿霉素，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48 h后撤藥，繼續(xù)觀察細(xì)胞的死亡情況3 d，選擇含順鉑、5-FU、阿霉素濃度分別為5、10、2μmol/L的完全RPMI-1640培養(yǎng)液(約20%的抑制濃度)作為耐藥細(xì)胞培養(yǎng)的起始濃度，設(shè)定順鉑濃度梯度為5—10—15—20—25—30—35—40—45—50μmol/L，5-FU濃度梯度為10—20—30—40—50—60—70—80—90—100μ mol/L，阿霉素濃度梯度為 2—4—6—8—10—12—14—16—18—20μmol/L。

1.2.2 MTT用于細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性測(cè)定

測(cè)定黃獨(dú)乙素對(duì)SGC-7901、SGC-7901/順鉑、SGC-7901/5-FU、SGC-7901/阿霉素細(xì)胞增殖的影響。

1.2.3 計(jì)算抑制率

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有計(jì)量資料以x±s表示，應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行方差分析，P＜0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05表明差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 收集MTT數(shù)據(jù)（吸光度），計(jì)算抑制率

由所取得數(shù)據(jù)可發(fā)現(xiàn)，4種細(xì)胞株分別加入10μmol/L、20μmol/L、40μ mol/L、80μmol/L、160μmol/L黃獨(dú)乙素所測(cè)得的吸光度與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），（表1）；同時(shí)，3種耐藥細(xì)胞株與加入同樣濃度黃獨(dú)乙素的SGC-7901細(xì)胞株所測(cè)得的抑制率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），（表 2）。

表1 4種細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度黃獨(dú)乙素所測(cè)得吸光度（x±s）

表2 4種細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度黃獨(dú)乙素所測(cè)得抑制率（x±s）

2.2 數(shù)據(jù)分析

2.2.1 不同濃度的黃獨(dú)乙素對(duì)SGC-7901、SGC-7901/順鉑、SGC-7901/5-FU和SGC-7901/阿霉素細(xì)胞株抑制率影響

加入相同濃度黃獨(dú)乙素后SGC-7901、SGC-7901/順鉑、SGC-7901/5-FU和SGC-7901/阿霉素細(xì)胞株抑制率接近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖1、表2），表明黃獨(dú)乙素對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞株的增殖抑制作用并沒(méi)有受到細(xì)胞株對(duì)順鉑、5-FU、阿霉素耐藥的影響。

圖1 黃獨(dú)乙素對(duì)4種細(xì)胞株的抑制率

2.2.2 加入不同濃度黃獨(dú)乙素后SGC-7901細(xì)胞株及其耐藥細(xì)胞株抑制率變化曲線(xiàn)

黃獨(dú)乙素對(duì)SGC-7901細(xì)胞株及其耐藥細(xì)胞株的增殖抑制率隨濃度變化曲線(xiàn)非常相似，表明黃獨(dú)乙素對(duì)SGC-7901、SGC-7901/順鉑、SGC-7901/5-FU和SGC-7901/阿霉素細(xì)胞株具有相似的增殖抑制作用，并且呈現(xiàn)一定程度的濃度依賴(lài)性，也就是說(shuō)黃獨(dú)乙素對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞株增殖抑制作用的劑量依賴(lài)性并未受到細(xì)胞株對(duì)順鉑、5-FU及阿霉素產(chǎn)生耐藥的影響（圖2）。

圖2 4種細(xì)胞株抑制率隨黃獨(dú)乙素濃度變化曲線(xiàn)

3 討論

隨著研究逐漸深入，中藥抗腫瘤機(jī)制也逐漸被發(fā)現(xiàn)并證實(shí)，目前人們所證實(shí)的中藥的抗腫瘤作用有：（1）增強(qiáng)機(jī)體免疫力，中藥可以調(diào)控體內(nèi)的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生一些如IL、TNF等細(xì)胞因子，進(jìn)而增強(qiáng)患者體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)功能[9]；（2）直接抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖，中藥可作用于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的不同階段，嚴(yán)重阻礙細(xì)胞生長(zhǎng)所需要DNA、RNA 蛋白質(zhì)的合成，使腫瘤細(xì)胞停止于增殖周期某階段； 或作用于腫瘤細(xì)胞能量代謝某環(huán)節(jié)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞呼吸鏈?zhǔn)茏瓒劳觯?或破壞細(xì)胞膜引起細(xì)胞自溶死亡[9]；（3）抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移能力，也是腫瘤患者在短時(shí)間內(nèi)死亡的主要原因，中藥可以有效降低腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，延緩其轉(zhuǎn)移速度[10]；（4）誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，腫瘤的發(fā)生多源于抑癌基因的失活或者原癌基因的激活，中藥可通過(guò)促使異常表達(dá)的癌基因得到逆轉(zhuǎn)、關(guān)閉或降低而達(dá)到抑癌作用[11]；（5）改變或阻滯腫瘤細(xì)胞的周期，中藥可作用于腫瘤細(xì)胞不同的細(xì)胞周期，使之發(fā)生停滯或者分化以達(dá)到抑癌作用[12]；（6）抑制腫瘤血管生成，腫瘤細(xì)胞不可能脫離血供而快速增殖，中藥可抑制腫瘤血管生成，通過(guò)減少腫瘤組織的血供來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)[13]；（7）逆轉(zhuǎn)多藥耐藥，增強(qiáng)常規(guī)化療藥物的作用，腫瘤細(xì)胞對(duì)常規(guī)化療藥物的多藥耐藥是化療中的重要難題，中藥可以通過(guò)多種方式降低腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥程度，從而輔助化療藥物抑制腫瘤生長(zhǎng)[14]。目前黃獨(dú)乙素抑制癌瘤細(xì)胞增殖的具體機(jī)制仍不完全清楚，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黃獨(dú)乙素能夠直接抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，證實(shí)，黃獨(dú)乙素對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞具有明顯抑制細(xì)胞增殖的作用，雖然未檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其有效濃度區(qū)間，但效果仍然值得關(guān)注，黃獨(dú)乙素對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制作用呈現(xiàn)出一定程度的濃度依賴(lài)性。近年來(lái)國(guó)內(nèi)發(fā)表多篇關(guān)于黃藥子及黃獨(dú)乙素抗腫瘤作用的類(lèi)似報(bào)道[15-17]，但不排除黃獨(dú)乙素對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制存在其他方面的機(jī)制，需進(jìn)一步研究。

當(dāng)前臨床應(yīng)用的一線(xiàn)化療藥物之間，或多或少存在著一定程度的交叉耐藥，當(dāng)腫瘤對(duì)于某一種化療藥物產(chǎn)生耐藥后，其他化療藥物對(duì)該腫瘤所產(chǎn)生的抑制效果有一定程度的降低，尤其是相同作用機(jī)制的化療藥物[18]。以往國(guó)內(nèi)外中藥的研究多針對(duì)其自身對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用，而中藥對(duì)腫瘤細(xì)胞的耐藥細(xì)胞株的增殖抑制作用研究較少，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者將目光轉(zhuǎn)向了中藥的輔助化療作用，比如有效抑制耐藥細(xì)胞增殖、逆轉(zhuǎn)多藥耐藥等研究方向[19]。黃獨(dú)乙素在本實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的低交叉耐藥性，人胃癌SGC-7901細(xì)胞對(duì)順鉑、5-FU、阿霉素產(chǎn)生耐藥并未影響黃獨(dú)乙素對(duì)其增殖抑制效果，這是傳統(tǒng)化療藥物難以克服的難題，也是化療失敗或者效果欠佳的主要原因，同樣也是當(dāng)前研究所希望發(fā)現(xiàn)的中藥輔助化療的作用。黃獨(dú)乙素作為中藥單一成分所表現(xiàn)出來(lái)的這種低交叉耐藥性是未來(lái)研究中開(kāi)發(fā)新型化療藥物應(yīng)該重視的，也是未來(lái)中藥抗腫瘤研究的熱點(diǎn)。

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