宋啟蘭 王燕青 王 寧

（1青島大學醫(yī)學院，青島266021；2山東省青島市海慈醫(yī)療集團，青島266033）

十棗湯對肺纖維化大鼠血清TNF-α和TGF-β1濃度的影響※

宋啟蘭1王燕青2*王 寧2

（1青島大學醫(yī)學院，青島266021；2山東省青島市海慈醫(yī)療集團，青島266033）

目的 通過檢測博萊霉素所致肺纖維化大鼠血清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）濃度，探討十棗湯對肺纖維化大鼠的治療作用及療效機制。方法 108只雄性健康Wistar大鼠隨機分為6組：空白對照、模型對照、強的松、十棗湯低劑量、十棗湯中劑量、十棗湯高劑量組，每組18只?？瞻讓φ战M以氣管內(nèi)注入生理鹽水的方法設(shè)立對照，余各組氣管內(nèi)注入博萊霉素建立肺纖維化模型，造模第2天始進行藥物干預(yù)，第14天、28天各處死9只大鼠，采集血清，取右肺，光鏡下觀察肺組織病理變化，ELISA法檢測血清中TNF-α和TGF-β1濃度。結(jié)果 給藥后第14、28天，與空白對照組相比，模型對照組出現(xiàn)典型肺纖維化改變，血清TNF-α和TGF-β1的濃度明顯升高 （P＜0.01）；與模型對照組相比，各藥物治療組肺纖維化程度明顯改善，血清TNF-α和TGF-β1的濃度顯著降低（P＜0.01）；十棗湯高劑量組血清TNF-α和TGF-β1的濃度較其余各組顯著降低 （P＜0.01）。給藥第14d時，強的松組與十棗湯低、中劑量組大鼠血清TNF-α濃度無顯著差異（P＞0.05），與十棗湯中劑量組血清中TGF-β1濃度無顯著差異 （P＞0.05）；28天時，強的松組大鼠血清TNF-α含量較十棗湯低劑量組低，有顯著差異 （P＜0.05），與十棗湯中劑量組無顯著差異 （P＞0.05）；強的松組與十棗湯低劑量組大鼠血清中TGF-β1濃度無顯著性差異 （P＞0.05），十棗湯中劑量組比強的松組大鼠血清中TGF-β1低，有顯著差異 （P＜0.05）。結(jié)論十棗湯可減輕博來霉素所致肺纖維化大鼠血清中TNF-α、TGF-β1的含量，延緩肺纖維化進展，減輕肺纖維化程度。

肺纖維化；十棗湯；大鼠；腫瘤壞死因子-α；轉(zhuǎn)化生長因子-β1；實驗研究

肺纖維化 （PF）是在炎癥損傷和修復(fù)過程中形成的一種病理改變，病情兇險，發(fā)病率逐年增高［1］。特發(fā)性肺纖維化 （IPF）是一種致死性疾病，預(yù)后極差［2-3］，現(xiàn)代醫(yī)學治療乏策，國內(nèi)外有眾多研究，但均無重大突破［4］。大量研究表明TNF-α、TGF-β1和PF形成密切相關(guān)［5］，研究表明IPF患者和博萊霉素所致小鼠血清中TGF-β1含量均較正常組升高［6］。十棗湯治療頑固性咳嗽等肺系疾病療效顯著［7］，導師在臨床中以十棗湯治療PF，短期內(nèi)即可改善癥狀，然其機制尚不明確，故設(shè)立本實驗，觀察十棗湯對肺纖維化大鼠血清中TNF-α、TGF-β1濃度的影響，為十棗湯治療PF提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康清潔級雄性Wsitar大鼠108只，許可證號：SCXK魯20170001。

1.2 實驗藥物及試劑

1.2.1 十棗湯 甘遂、大戟、芫花各等分，研末，由青島健聯(lián)藥店有限公司提供，用藥劑量據(jù)大鼠與人每公斤體重折算系數(shù)計算［8］，十棗湯低、中、高劑量組大鼠，每次每只需用上述生藥各9mg、18mg、54mg，即三藥總量分別為27mg、54mg、162mg，大棗每次每只大鼠540mg，臨用前將三組藥物粉末混合均勻，分別用棗湯配制成9mg／ml、18mg／ml、54mg／ml的混懸液，其中每ml含大棗生藥180mg。

1.2.2 藥品及試劑 注射用鹽酸博萊霉素：日本化藥株式會社，規(guī)格15mg，批號Y20262。配制成5mg／ml的溶液。強的松片：上海信誼藥廠，規(guī)格5mg，研末，以生理鹽水制成濃度為0.5mg／ml懸濁液。水合氯醛：海慈醫(yī)療集團制劑室提供。TNF-α、TGF-β1ELISA試劑盒（欣博盛生物科技有限公司）。

1.3 儀器 PYX-DHS-X隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海市躍進醫(yī)療器械廠；Nikon YS100光學顯微鏡：日本Olympus公司；酶標儀（Multi skan Ascent V 1.24 345-0063T浙江分析儀器廠）。

2 實驗方法

2.1 動物分組 按隨機數(shù)字表法將108只wistar大鼠分為正常對照、模型對照、強的松、十棗湯低劑量、十棗湯中劑量、十棗湯高劑量組，每組18只。

2.2 動物模型的制備 模型對照及各藥物治療組共90只大鼠，按照文獻報道［9］，以經(jīng)咽喉氣管插管注入博萊霉素的方法復(fù)制PF模型。腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，以泵前軟管行氣管插管，于大鼠吸氣瞬間，迅速向氣管內(nèi)注入博萊霉素溶液（1ml／kg），再向氣管內(nèi)注入空氣，將鼠板直立左右旋轉(zhuǎn)數(shù)次，并輕揉胸部片刻，促使藥物均勻地分布于肺組織內(nèi)。空白對照組采用同樣方法注入生理鹽水（1ml／kg）。

2.3 給藥方法和途徑 各組均從造模第2天開始給藥，用藥量據(jù)大鼠與人每公斤體重折算系數(shù)［7］計算，以灌胃方式給藥，每天一次。強的松組給予強的松5mg／kg／d；十棗湯低、中、高劑量組大鼠按三藥總量135mg／kg／d、270mg／kg／d、710mg／kg／d給藥；空白對照和模型對照組均給予相同體積的生理鹽水。

2.4 觀察指標與檢測方法 給藥后第14天各組隨機抽取9只大鼠處死，第28天處死剩余大鼠。腹腔注射水合氯醛麻醉，打開腹腔，腹主動脈取血5ml，低溫下離心，取上清液，-20℃保存?zhèn)錅y；摘取右肺，甲醛固定24h，行HE染色，觀察所選取肺組織的病理變化情況，按定量分級標準定量肺泡炎和肺纖維化的程度［10］；ELISA法檢測大鼠血清TNF-α、TGF-β1含量，操作嚴格按說明書的步驟進行。

2.5 統(tǒng)計學處理 以SPSS17.0進行分析，結(jié)果以均數(shù)±標準差（±s）表示，符合正態(tài)分布及方差齊性，則進行單因素方差分析，多重比較用LSD法；若方差不齊，采用多重秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠存活率 十棗湯中劑量組大鼠于造模第二天死亡1只，強的松組第9天死亡1只，其余各組無大鼠死亡，各組存活率比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3.2 各組大鼠肺組織的病理表現(xiàn)

3.2.1 肺整體形態(tài)觀察 空白對照組：呈粉紅色，表面光滑，彈性好。模型對照組：表面凹凸不平，顏色暗，可見斑點狀出血，部分肺葉體積縮小，可見灰白色結(jié)節(jié)，彈性差。強的松組和十棗湯低、中劑量組：顏色略暗紅，表面稍粗糙，彈性可，出血點、結(jié)節(jié)等情況較輕。十棗湯高劑量組較空白對照組大鼠肺組織外觀無明顯差異。

3.2.2 HE染色 光鏡下觀察：空白對照組肺內(nèi)結(jié)構(gòu)清晰，肺泡結(jié)構(gòu)完整，大小均勻，肺泡壁及肺泡間隔未見增厚，肺泡腔內(nèi)未見滲出。模型對照組：第14天可見肺泡間隔增厚，大量炎癥細胞浸潤，部分肺泡結(jié)構(gòu)破壞；第28天，肺泡壁增厚，肺泡腔縮小，部分肺泡塌陷、融合，間質(zhì)有膠原纖維沉積，肺纖維化程度明顯加重，與文獻報道［10］一致，證明造模成功。

光鏡下觀察HE染色結(jié)果，依據(jù)Szapiel［10］等提供之方法確定肺泡炎和纖維化的程度。第14天、28天大鼠肺泡炎病理學積分結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠第14天、28天肺泡炎病理學積分結(jié)果±s，分）

表1 各組大鼠第14天、28天肺泡炎病理學積分結(jié)果±s，分）

注：F=13.713，13.778。●與空白對照組相比，P＜0.05；※與模型對照組相比，P＜0.05；△與強的松組比較，P＞0.05；▲與強的松組相比，P＜0.05；☆與空白對照組相比，P＞0.05，與十棗湯高劑量相比，P＜0.05

組別14d 28d空白對照組1.470±0.284 1.549±0．296模型對照組2．598±0．339●2．475±0．291●強的松組2．137±0．296●※2．208±0．223●※十棗湯低劑量組2．223±0．337●※△★2．153±0．202●※△★十棗湯中劑量組2．121±0．347●※△★2．125±0．188●※△★十棗湯高劑量組1．814±0．176☆※▲1．863±0．344●※▲

3.3 各組大鼠血清TNF-α、TGF-β1含量比較

3.3.1 給藥第14天時各組大鼠血清中TNF-α、TGF-β1含量的比較 第14天時，模型對照組及各藥物治療組大鼠血清TNF-α、TGF-β1含量均較空白對照組高，有顯著差異 （P＜0.01）；各藥物治療組大鼠血清中TNF-α、TGF-β1的含量較模型對照組低，有顯著差異（P＜0.01）；十棗湯高劑量組大鼠血清中TNF-α、TGF-β1含量較余治療組低，有顯著差異 （P＜0.01）；強的松組與十棗湯低、中劑量組相比，大鼠血清TNF-α的含量差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05）；強的松組與十棗湯低劑量組大鼠血清中TGF-β1含量差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05）；十棗湯低劑量組與十棗湯中劑量組相比，大鼠血清TNF-α、TGF-β1含量差異無統(tǒng)計學意義 （P ＞0.05）。

表2 第14天各組大鼠血清中TNF-α、TGF-β1含量比較 （±s，pg／ml）

表2 第14天各組大鼠血清中TNF-α、TGF-β1含量比較 （±s，pg／ml）

注：F=510.726，599.905；★與空白對照組比較，P＜0.01；■ 與模型組比較，P＜0.01；△與強的松組比較，P＜0.01；▲與十棗湯高劑量組比較，P＜0.01；☆與強的松組比較，P＞0.05；●與強的松組比較，P＜0.05

?

3.3.2 第28天各組大鼠血清TNF-α、TGF-β1含量的比較 第28天時，模型對照組及各藥物治療組大鼠血清TNF-α、TGF-β1含量均較空白對照組高，有顯著性差異 （P＜0.01）；各藥物治療組大鼠血清中TNF-α、TGF-β1的含量均較模型對照組低，有顯著性差異 （P＜0.01）；十棗湯高劑量組大鼠血清中TNF-α、TGF-β1含量均較其他各治療組低，有顯著性差異 （P＜0.01）；強的松組大鼠血清中TNF-α含量較十棗湯低劑量組低，有顯著性差異 （P＜0.05）；十棗湯中劑量組與強的松組相比較，大鼠血清TNF-α的含量差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05）；強的松組與十棗湯低劑量組大鼠血清中TGF-β1含量差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05）；十棗湯中劑量組大鼠血清中TNF-α含量比十棗湯低劑量組低，有顯著性差異 （P＜0.05）；十棗湯低劑量組和十棗湯中劑量組大鼠血清中TGF-β1含量差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05）。

表3 第28天各組大鼠血清TNF-α、TGF-β1含量比較±s，pg／ml）

表3 第28天各組大鼠血清TNF-α、TGF-β1含量比較±s，pg／ml）

注：F=594.663，842.268；★與空白對照組比較，P＜0.01；■與模型組比較，P＜0.01；△與強的松組比較，P＞0.05；▲與強的松組比較，P＜0.05；◆與十棗湯高劑量組比較，P＜0.01；☆與十棗湯低劑量組比較，P＞0.05

組別n TNF-α（pg／ml）TGF-β1（pg／ml）空白對照組9 2.641±0．297 10．444±0．524模型對照組9 12．686±0．551★41．953±1．473★■強的松組9 10．107±0．513★■25．544±1．040★■十棗湯低劑量組9 10．670±0．420★■▲◆25．087±1．374★■△◆十棗湯中劑量組9 10．138±0．516★■△◆24．452±0．800★■▲◆☆十棗湯高劑量組9 7．822±0．311★■▲22．082±0．927★■▲

4討論

肺纖維化是現(xiàn)代醫(yī)學間質(zhì)性肺疾病范疇，病理上以炎性病變和損傷所致的肺組織結(jié)構(gòu)破壞為特征［11］。具體發(fā)病機制尚未完全闡明，大量研究發(fā)現(xiàn)細胞因子對PF的形成與發(fā)展有重要作用。

PF屬于中醫(yī)學氣短、咳嗽、喘證、肺痿、肺痹等范疇［12］；導師王燕青主任認為PF病因無論痰飲、瘀血、邪毒等均為實證，病機為邪氣壅實，且因其病情兇險，治療需以猛藥峻劑攻其邪。十棗湯乃仲景治療咳喘常用方，方中甘遂、大戟、芫花三藥功可逐水散結(jié)止咳喘，且皆入肺經(jīng)，肺與大腸相表里，十棗湯可引起峻瀉，使邪氣從大腸而去。且氣能行津，津能載氣，瀉水實為瀉肺中邪氣，實乃 “潔凈府，去菀陳莝法也?！?/p>

TNF-α可介導眾多炎癥和免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)，生物學活性廣泛，過度表達的內(nèi)源性TNF-α可促進PF的形成［13］。TNF-α可聚集炎癥細胞，激活嗜中性粒細胞，介導肺泡炎癥反應(yīng)，刺激、促進膠原合成，誘導生成TGF-β1，誘導細胞凋亡和壞死，在PF發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用［14-15］。TGF-β1是目前已知最有效直接刺激膠原纖維合成的細胞因子，被喻為細胞因子網(wǎng)絡(luò)的開關(guān)，參與PF的誘導及啟動，制約著PF發(fā)展的方向［13］。它可促進成纖維細胞的增殖聚集，刺激合成膠原蛋白，增加肺間質(zhì)膠原纖維含量［15］，抑制纖溶酶原和膠原蛋白酶活性，減少細胞外基質(zhì)降解［16］，影響血小板源性生長因子、血管內(nèi)皮生長因子等的表達和白介素、干擾素等的合成分泌，促進PF的形成。綜上，TNF-α與TGF-β1在PF的發(fā)病中有重要意義。

本研究顯示，模型對照組大鼠血清中TNF-α與TGF-β1含量較空白對照組顯著升高，與文獻報道一致［6］，說明博萊霉素不僅誘導大鼠肺纖維化，還介導了全身的炎癥反應(yīng)。十棗湯各劑量組大鼠肺泡炎評分和血清中TNF-α和TGF-β1含量均低于模型對照組，提示十棗湯能夠有效緩解博萊霉素誘導的PF程度，其機制可能與降低血清中TNF-α和TGF-β1水平有關(guān)。

綜上所述，十棗湯對博萊霉素所誘導的大鼠PF有治療作用，為峻下逐水法治療肺纖維化提供了初步實驗依據(jù)，為PF的治療提供了新的出路，但其發(fā)病機制復(fù)雜，還需大量后續(xù)實驗及臨床研究。

［1］陳灝珠，林果為．實用內(nèi)科學［M］．13版．北京：人民衛(wèi)生出版社，2009：1817-1825．

［2］Raghu G，et al．An Official ATS／ERS／JRS／ALAT Statement：Idiopathic Pulmonary Fibrosis：Evidence-based Guidelines for Diagnosis and Management．Am J Respir Crit Care Med．2011 Mar 15；183（6）：788-824．

［3］Nathan SD，Shlobin OA，Weir N，et al．Long-term course and prognosis of idiopathic pulmonary fibrosis in the new millennium［J］．Chest，2011 Jul，40（1）：221-229．

［4］Cottin V．Changing the idiopathic pulmonary fibrosis treatment approach and improving patient outcomes［J］．Eur Respir Rev．2012，Jun 1，21（124）：161-167．

［5］Francesca LS，Ekaterina G，Ann R，et al．Human eosinophils regulate human lung-and skin-derived fibroblast properties in vitro：A role for transforming growth factorβ（TGF-β）［J］．PNAS 1999，96（7）：9660-9665．

［6］芮煒瑋，易祥華．轉(zhuǎn)化生長因子β1及相關(guān)細胞因子在肺纖維化發(fā)生中的作用［J］．同濟大學學報，2010，31（3）：133-136．

［7］姜宗瑞．十棗湯的臨床運用［J］．中國社區(qū)醫(yī)師，2003，19（8）：37-38．

［8］黃繼漢，黃曉暉，陳志揚，等．藥理試驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算［J］．中國臨床藥理學與治療學，2004，9（9）：1069-1072．

［9］齊曼古麗·吾守爾，夏宇，巴哈爾古麗·米吉，提等．博萊霉素致大鼠肺纖維化模型的建立方法及比較［J］．新疆醫(yī)科大學學報，2005，28（6），495-498．

［10］Szapiel SV，Elson NA，F(xiàn)ulmer JD，et al．Bleomycin induced interstitial pulmonary disease in the nude，athymic mouse［J］．Am Rev Respir Dis，1979，120（4）：893-899．

［11］SongJS，KangCM，RheeCK，et al．Effects of elastase inhibitor on the epithelial cell apoptosis in bleomycin-induced pulmonary fibrosis［J］．Exp Lung Res，2009，35（10）：817-829．

［12］侯志英．肺纖維化的中醫(yī)藥研究進展［J］．中醫(yī)藥學報，2009，37（3）：82-84．

［13］楊霞，肺纖維化中細胞因子網(wǎng)絡(luò)［J］．武警醫(yī)學院學報，2009，18，（3）：245-248．

［14］Zhu Z，Zheng T，Homer RJ，et al．Acidic mammalian chitinase in asthmatic Th2 inflammation and IL-13 pathway activation［J］．Science，2004，304：1678-1682．

［15］于露，劉躍建．腫瘤壞死因子-α及轉(zhuǎn)化生長因子-β1在肺纖維化形成中的作用研究進展［J］．實用醫(yī)院臨床雜志，2012，9（3）：163-165．

［16］Branton M H，Kopp J B．TGF-beta and fibrosis［J］．Microbes Infect，1999，1（15）：1349-1365．

The Ef f e c t o f Shiz ao tan g on Se r um TNF-αan d TGF-βLe v el s-αan d TGF-βLe v els in r at s wit h Pulmo na r y Fib r o sis Rat s

Song Qilan1W ang Yanqing2Wang N ing2
（1 Qingdao University M edical College'QingDao'266021'China;2 Qin Dao H iser M edical G roup'QingDao 266033'China'China）

Objective To assess the efficacy and mechanism of Shizao Tang in the treatment of pulmonary fibrosis in rats through detecting the levels of serum Tumor necrosis actor-alpha（TNF-α）and Transforming growth factor betal（TGF-β1）．Methods 108 male Wistar rats were equally randomized to six groups as normal control，model control，prednisone，Shizao Tang low dose，Shizao Tang middle dose，Shizao Tang high dose．Normal control group was given normal saline instead，while the rest of the 5 groups induced pulmonary fibrosis with bleomycin endotracheally．Corresponding drugs were given the next day upon completion of the model．After 14 and 28 days of medication，9 rats in each group were sacrificed respectively．The pathology of lung tissue was observed microscopically．Serum samples were collected for TNF-αand TGF-βdetection by ELLISA．Results Compared with normal control group，the lung tissue in the model control group showed obvious pulmonary alveolitis and fibrosis．a(chǎn)nd the levels of TGF-β1and TNF-αin serum were significant higher（P＜0.01）．Compared with model control group，pulmonary fibrosis in each treatment group significantly improved，and TNF-αand TGF-β1levels were lower（P＜0.01）；TNF-αand TGF-β1levels in Shizao Tang high dose group were much lower than other groups（P＜0.01）；Deference between prednisone group and Shizao Tang low dose，prednisone group and Shizao Tang middle dose on TNF-αlevels was not markedly（P＞0.05），and there had not significant difference between prednisone group and Shizao Tang middle dose group on TGF-β1levels（P＞0.05）on the 14th day．On the 28th day，compared with prednisone group，

the TNF-αlevels in Shizao Tang low dose group were higher（P＜0.05），but the difference between prednisone group and Shizao Tang middle dose group was not significantly（P＞0.05），TGF-β1levels in Shizao Tang middle dose group were much lower（P＜0.05），but there was not significantly difference between Shizao Tang low dose group and prednisone group on TGF-β1levels（P＞0.05）．Conclusion Shizao Tang may decline TNF-αand TGF-β1levels in rats with pulmonary fibrosis induced by bleomycin and relieve the degree of pulmonary fibrosis．

Pulmonary fibrosis；rats；Shizao Decoction；TNF-α；TGF-β1

doo：10.3969／j.issn.1672-2779.2014.08.100

1672-2779（2014）-08-0001-02

山東省青島市中醫(yī)科研計劃項目［No：2014-ZYY007］

*通訊作者

楊 杰 本文校對：

2013-12-19）