張海英，張 紅（新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部，烏魯木齊830000）

［本文編輯］蘭 芬

地錦草為大戟科植物地錦（EuphorbiahumifusaWilld.）或斑地錦（EuphorbiamaculataL.）的干燥全草，具有清熱解毒、涼血止血、利濕退黃、增強(qiáng)肝脾功能的作用，用于治療痢疾、泄瀉、皮膚瘙癢、瘡癤癰腫等疾病［1］。地錦草資源十分豐富，全草含黃酮類（槲皮素等）、沒食子酸、內(nèi)消旋肌醇等活性成分。提取地錦草中的黃酮類成分常采用加熱回流法，該方法具有溶劑消耗量大、加熱時間長的缺點(diǎn)。超聲提取法利用超聲波的空化作用、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)等加速細(xì)胞內(nèi)有效物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散和溶解，具有快速、安全、效率高等優(yōu)點(diǎn)。超微粉碎是指利用機(jī)械或流體力學(xué)的途徑將物料粉碎至粒徑＜10μm微粒的過程，超微粉末具有良好的溶解性、分散性、吸附性和化學(xué)反應(yīng)活性等特殊理化性質(zhì)［2］。本研究將地錦草藥材超微粉碎后，用超聲提取法提取其中的總黃酮，采用單因素實驗結(jié)合正交試驗設(shè)計，優(yōu)化地錦草中總黃酮的提取工藝條件。

1 材 料

1.1 儀器 SYFM－8型超微粉碎振動磨（濟(jì)南松岳機(jī)器有限責(zé)任公司）；Cintra－20紫外－可見分光光度計（澳大利亞GBC科學(xué)儀器公司）；SK3300LH超聲清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品和試劑 地錦草購于新疆自治區(qū)維吾爾醫(yī)院，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院李永和主任中藥師鑒定為地錦草（EuphorbiahumifusaWilld.）；蘆丁對照品（批號100080－200707，中國食品藥品檢定研究院）；亞硝酸鈉（分析純，天津市福晨化學(xué)試劑有限公司）；硝酸鋁、95%乙醇、石油醚（天津市百世化工有限公司）；氫氧化鈉（分析純，上?；瘜W(xué)試劑集團(tuán)公司）。

2 方法和結(jié)果

2.1 溶液的配制（1）蘆丁對照品溶液：精密稱取蘆丁對照品10.0mg，置50ml量瓶中，加95%乙醇適量，超聲10min使溶解，加95%乙醇定容，即得0.2mg／ml的蘆丁對照品溶液。（2）供試品溶液：地錦草藥材經(jīng)超微粉碎振動磨粉碎15min，得到超微粉末。精密稱取10g地錦草超微粉末，將95%乙醇加適量蒸餾水稀釋成70%濃度，用70%乙醇溶液100ml超聲提取60min，并補(bǔ)足減失的重量。濾紙過濾，濾液用石油醚脫色后置250ml量瓶中，用70%乙醇定容，即得。

2.2 最大吸收波長的選擇 精密量取供試品溶液和蘆丁對照品溶液各2ml，置25ml量瓶中，加70%乙醇至6ml，加4%亞硝酸鈉溶液1ml，搖勻，放置6min。加10%硝酸鋁溶液1ml，搖勻，放置6min，加10%氫氧化鈉溶液10ml，用70%乙醇定容至刻度。放置15min使反應(yīng)完全，在紫外－可見分光光度計下400～700nm掃描，確定最大吸收波長為500nm。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密量取蘆丁對照品溶液1、2、3、4、5、6ml置25ml量瓶中，加95%乙醇5、4、3、2、1、0ml使至6ml，按2.2項下自“加4%亞硝酸鈉溶液1ml”開始操作，以95%乙醇作為空白對照，用紫外－可見分光光度計在500nm處測定吸光度（A）［3］。以濃度（c）為橫坐標(biāo)，A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A＝12.814c＋0.004 5（r＝0.999 9），表明蘆丁在8～48μg／ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度實驗 精密吸取蘆丁對照品溶液2ml，按2.2項下操作測定含量，重復(fù)測定6次。計算得到RSD＝1.23%（n＝6），表明該方法精密度良好。

2.3.3 加樣回收率實驗 精密稱取9份已知總黃酮含量為6.18mg／g的地錦草超微粉末5g，按2.1項下方法（2）制備供試品溶液。將供試品溶液置于25ml量瓶中，每3份精密加入濃度為0.2mg／ml的蘆丁對照品溶液0.5、1.0、1.5ml，70%乙醇定容至刻度，得到低、中、高濃度分別為4、8、12μg／ml的混合樣品溶液。按2.2項操作測定吸光度，計算加樣回收率，結(jié)果低、中、高濃度的加樣回收率分別為（99.23±1.21）%、（100.79±1.76）%、（99.47±2.14）%（n＝3）。

2.3.4 重復(fù)性實驗 稱取10g地錦草超微粉末，共5份，按2.1項下方法（2）制備供試品溶液，測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算得到總黃酮的平均含量為（6.18±0.11）mg／g，RSD＝1.78%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性實驗 精密量取供試品溶液2ml，按2.2項下操作，在溶液配制后2h內(nèi)每隔15min測定1次吸光度，計算得到RSD＝1.21%（n＝9），表明供試品溶液在配制后2h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 單因素實驗 采用單因素實驗對超聲提取法的乙醇濃度、乙醇用量、提取時間、提取次數(shù)等因素進(jìn)行考察?？疾炷硞€因素時，其他影響因素固定不變，評價該因素對提取效果的影響。

2.4.1 提取工藝的評價指標(biāo) 提取工藝評價指標(biāo)是總黃酮含量和浸膏得率的綜合評分，其中總黃酮含量和浸膏得率的權(quán)重系數(shù)分別是60和40?？傸S酮含量評分＝（總黃酮含量／最大總黃酮含量）×60，浸膏得率評分＝（浸膏得率／最大浸膏得率）×40，綜合評分＝總黃酮含量評分＋浸膏得率評分。

2.4.2 乙醇濃度的影響 分別用濃度為10%、30%、50%、70%、90%的12倍體積的乙醇溶液為溶媒進(jìn)行提取，每次提取時間為1h，提取次數(shù)為2次，計算綜合評分。結(jié)果用10%和30%的乙醇提取時，綜合評分幾乎相同，分別為（30.4±0.9）和（31.2±1.2）（n＝3）。隨著乙醇濃度的增加，綜合評分提高，70%乙醇提取時綜合評分達(dá)最高值，為（87.1±1.6）（n＝3）；90%乙醇提取時綜合評分為（86.8±2.1）（n＝3）?？紤]到用高濃度乙醇的成本較高，因此選用濃度為70%的乙醇作為提取溶媒。

2.4.3 乙醇用量的影響 分別用6、9、12、15、18倍體積的70%乙醇溶液進(jìn)行提取，提取次數(shù)為2次，提取時間為1h，計算綜合評分。結(jié)果以6倍和9倍體積的乙醇提取時，綜合評分分別為（72.1±1.1）和（80.5±1.2）（n＝3）；12倍體積的乙醇提取時綜合評分達(dá)最高值，為（85.2±2.1）（n＝3）；15倍和18倍乙醇提取時，綜合評分分別為（84.8±1.9）和（84.6±1.8）（n＝3），與12倍乙醇提取幾乎相同?？紤]到大生產(chǎn)中乙醇用量的增加，會導(dǎo)致后續(xù)濃縮、干燥的工作量大幅增加，從而增加生產(chǎn)成本，故選擇9倍、12倍、15倍體積的乙醇用量進(jìn)入正交試驗。

2.4.4 提取時間的影響 用12倍體積的70%乙醇分別提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h，提取次數(shù)為2次，計算綜合評分。結(jié)果提取時間為0.5、1.0、1.5h時，綜合評分幾乎相同，分別為（82.1±2.0）、（79.8±1.8）和（81.6±1.7）（n＝3）。隨著提取時間延長，綜合評分增加。提取2.0和2.5h時，綜合評分達(dá)（86.4±1.9）和（85.8±1.7）（n＝3）?？紤]到總黃酮的提取率較高，在較短時間內(nèi)已經(jīng)溶出了大部分，并且隨著提取時間的延長，增加了無效物質(zhì)的溶出，因此選擇0.5、1.0、1.5h三個提取時間進(jìn)入正交試驗。

2.4.5 提取次數(shù)的影響 用12倍量的70%乙醇分別提取1、2、3、4次，每次提取時間為1h，計算綜合評分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，提取1次和2次時，綜合評分分別為（61.2±1.2）和（78.6±1.5）（n＝3）；提取3次時，綜合評分達(dá)最高值，為（89.6±2.2）（n＝3）；提取4次時，綜合評分為（88.5±1.7）（n＝3），與提取3次幾乎相同?？紤]到提取時間過長可能導(dǎo)致總黃酮的分解，故選擇提取1、2、3次三個水平進(jìn)入正交試驗。

2.5 正交試驗 設(shè)計L9（34）正交試驗，見表1。分別精密稱取地錦草超微粉末10g，按正交設(shè)計安排實驗［4］，測定不同提取條件得到的總黃酮含量和浸膏得率，計算綜合評分，進(jìn)行統(tǒng)計分析。正交試驗結(jié)果見表2和表3。由表2直觀分析可知，各因素對提取綜合評分的影響程度為：提取次數(shù)＞提取時間＞乙醇用量，最佳提取工藝為A2B2C3。經(jīng)方差分析可見，提取次數(shù)對提取效果的影響有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而提取時間和乙醇用量的影響無統(tǒng)計學(xué)意義。故確定最佳提取工藝為A2B2C3，即地錦草超微粉末加12倍量的70%乙醇溶液回流提取2次，每次提取1.5h。

表1 正交試驗設(shè)計的因素和水平Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment design

表2 正交試驗設(shè)計和結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal test

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis

2.6 驗證實驗 稱取地錦草超微粉末50g，共3份，加12倍量70%乙醇溶液提取2次，每次1.5h。用70%乙醇補(bǔ)足減失重復(fù)，濾紙過濾，濾液用石油醚脫色后置2500ml量瓶中，用70%乙醇定容即得供試品溶液，按2.2項方法顯色后測定吸光度。結(jié)果測得藥材樣品中總黃酮含量為（6.53±0.04）mg／g，浸膏得率為（15.27±0.55）%（n＝3）。結(jié)果表明，檢測指標(biāo)接近或高于正交表中最優(yōu)值，表明優(yōu)選的提取條件穩(wěn)定、可行。

3 討 論

藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，地錦草有良好的抗菌、抗炎和止血作用，對游離羥基引發(fā)的DNA氧化損傷有一定的保護(hù)作用，并且可以清除和抑制自由基，是一種較強(qiáng)的抗氧化植物［5］。地錦草中含有黃酮類（槲皮素等）、沒食子酸、內(nèi)消旋肌醇等活性化合物，其水提液和醇提液均具有較強(qiáng)的黃酮反應(yīng)，因此本研究選擇總黃酮含量和浸膏得率作為提取效果的評價指標(biāo)?？傸S酮的含量測定方法較多，常用方法有對照品測定法、金屬離子絡(luò)合法、HPLC法和熒光分光光度法等［6］。金屬離子絡(luò)合法的原理是基于黃酮類化合物分子中具有3－羥基、5－羥基或鄰二酚羥基，易與金屬鹽類如鋁鹽、鋯鹽、鍶鹽、鎂鹽等反應(yīng)，生成有色的金屬絡(luò)合物。亞硝酸鈉－硝酸鋁－氫氧化鈉顯色反應(yīng)由于測定結(jié)果穩(wěn)定、可靠、重現(xiàn)性好，常用于黃酮類化合物的含量測定，本研究也選用該方法測定地錦草提取液中總黃酮的含量。

超聲提取主要是利用超聲波的空化作用加速植物有效成分的浸出，另外超聲波的次級效應(yīng)，如機(jī)械振動、乳化、擴(kuò)散、擊碎、化學(xué)效應(yīng)等也能促進(jìn)待提成分的擴(kuò)散和釋放。與傳統(tǒng)回流提取法相比，雖然超聲提取的浸膏得率較低，但有效成分提取率高，提取時間短，省時、節(jié)能，操作方便，尤其對于熱敏感成分更為適宜，因此被廣泛用于植物有效成分的提取。超微粉碎是采用振動磨粉碎藥材，提高細(xì)胞破壁率，從而提高化學(xué)成分的溶出速率和溶出量；但由于超微粉末太細(xì)，加熱回流提取時要持續(xù)攪拌，否則容易糊化，給操作帶來困難。本研究將超微粉碎技術(shù)和超聲提取工藝相結(jié)合用于地錦草中總黃酮的提取，方法操作簡單、提取效率高、生產(chǎn)成本小，適宜在制劑生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典.2010年版 一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：118.State Pharmacopoeia Committee.Pharmacopoeia of the People’s Republic of China.2010ed.Volume 1［S］.Beijing：Chinese Medical Science Press，2010：118.In Chinese.

［2］張海英，劉 飛.超微粉碎對羅勒顯微特征及總黃酮體外溶出的影響［J］.藥學(xué)服務(wù)與研究，2014，14（1）：35－38.Zhang HaiYing，Liu Fei.Effects of ultramicro pulverization on the microscopic characteristics ofOcimumbacilicumand on theinvitrodissolution of total flavone［J］.Pharm Care Res，2014，14（1）：35－38.In Chinese with English abstract.

［3］辛海量，胡 園，張巧艷，等.不同產(chǎn)地蔓荊子中黃酮類成分含量分析［J］.藥學(xué)服務(wù)與研究，2010，10（6）：429－431.Xin HaiLiang，Hu Yuan，Zhang QiaoYan，etal.Content determination of flavonoids inVitextrifoliaL.from different districts［J］.Pharm Care Res，2010，10（6）：429－431.In Chinese with English abstract.

［4］黃家錕，宋學(xué)偉，韓泳平，等.正交設(shè)計法優(yōu)化大花紅景天多糖的提取工藝［J］.華西藥學(xué)雜志，2007，22（6）：650－651.Huang JiaKun，Song XueWei，Han YongPing，etal.Optimization of the extraction technology ofRhodiolacrenulatapolysaccharides by orthogonal design［J］.West China J Pharm Sci，2007，22（6）：650－651.In Chinese with English abstract.

［5］阿不都熱依木，阿不都艾尼，哈木拉提，等.五種維吾爾藥的清除羥自由基及抗DNA損傷作用研究［J］.中草藥，2001，32（3）：236－238.Abudureyimu，Abuduaini，Hamulati，etal.Studies on scavenge of hydroxyl radical and protection of DNA damage by 5 different Uighur medicinal herbs［J］.Chin Tradit Herb Drugs，2001，32（3）：236－238.In Chinese with English abstract.

［6］顏仁梁，劉志剛.中草藥、中藥制劑中總黃酮類化合物含量測定方法綜述［J］.廣州醫(yī)藥，2005，36（6）：6－10.Yan RenLiang，Liu ZhiGang.Review of the content determination methods of total flavanoids in Chinese herbal drugs and traditional Chinese drug preparations［J］.Guangzhou Med J，2005，36（6）：6－10.In Chinese.