劉哲鵬，潘 風(fēng)，施與群

［1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院藥物制劑（設(shè)備與工藝）研究所，上海200093；2.上海美優(yōu)制藥有限公司產(chǎn)品開發(fā)部，上海201423］

［本文編輯］蘭 芬

單用一種藥物治療艾滋病容易產(chǎn)生耐藥性，組合藥物治療（又稱雞尾酒療法）的療效明顯優(yōu)于單藥治療，并且可以延緩耐藥性的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，與單藥治療相比，雞尾酒療法使艾滋病患者的死亡率降低逾80%，已成為標(biāo)準(zhǔn)的艾滋病治療方案［1］。雞尾酒療法同時(shí)使用3～4種藥物，針對艾滋病毒繁殖周期的不同環(huán)節(jié)，全面抑制或殺滅艾滋病毒。經(jīng)雞尾酒療法治療后，部分患者體內(nèi)的艾滋病毒可長期保持在檢測限以下?；陔u尾酒療法策略開發(fā)的抗艾滋病復(fù)方制劑一般包括逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑。目前國內(nèi)已上市的艾滋病治療藥物多為單方或雙復(fù)方制劑，存在耐藥性、患者用藥依從性差等問題，臨床迫切需要療效確切、不易產(chǎn)生耐藥性的抗艾滋病復(fù)方制劑，但目前國內(nèi)尚未生產(chǎn)采用雞尾酒療法的復(fù)方制劑。作者所在的課題組研發(fā)了由奈韋拉平、齊多夫定和拉米夫定組成的抗艾滋病復(fù)方片劑，這3種藥物均為WHO推薦的艾滋病組合治療藥物［2－4］。由于復(fù)方片劑的3種主藥理化性質(zhì)各不相同，因此工藝開發(fā)難度較大，特別是藥物溶出不合格、有關(guān)物質(zhì)來源復(fù)雜且含量超標(biāo)、藥物含量均勻度不合格等問題，均會(huì)影響產(chǎn)品質(zhì)量［5，6］。本研究對奈韋拉平／齊多夫定／拉米夫定復(fù)方片劑的處方工藝進(jìn)行篩選、優(yōu)化，得到最優(yōu)處方，并考察了樣品的穩(wěn)定性，最終確立了可以進(jìn)行生產(chǎn)的處方工藝條件。本研究為國內(nèi)企業(yè)生產(chǎn)該藥提供了部分依據(jù)。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 Dionex P680型HPLC儀（美國戴安公司）；GL－5型干法制粒機(jī)（浙江明天機(jī)械有限公司）；RCZ－6CZ型藥物溶出度儀、LB－2D智能崩解實(shí)時(shí)測定儀、YPJ－200B片劑硬度計(jì)（上海黃海藥檢儀器有限公司）；FT－2000片劑脆碎度檢查儀（天大天發(fā)科技有限公司）；低溫光照儀（藥物制劑國家工程研究中心）；GSP－9050MBE型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；BPS－250C恒溫恒濕箱（上海一恒科技有限公司）；Welchrom－C18色譜柱（月旭材料科技有限公司）；BS 224S萬分之一電子分析天平（德國Satorious公司）。

1.2 藥品和試劑 奈韋拉平原料藥（含量99.7%，批號C5021－10－027，浙江華海藥業(yè)股份有限公司）；齊多夫定原料藥（含量99.6%，批號1103001，上?，F(xiàn)代制藥股份有限公司）；拉米夫定原料藥（含量99.6%，批號LZ01100601，浙江永寧藥業(yè)股份有限公司）。奈韋拉平對照品（批號100641－200401）、齊多夫定對照品（批號100672－200401，中國食品藥品檢定研究院）；拉米夫定對照品（含量99.7%，批號1356836，美國藥典委員會(huì)提供）。微晶纖維素（德國瑞登梅爾公司）；乳糖（德國美劑樂集團(tuán)）；預(yù)膠化淀粉（Starch 1500，上?？房蛋录夹g(shù)有限公司）；羧甲基淀粉鈉（永日化學(xué)工業(yè)股份有限公司）；聚乙烯吡咯烷酮（PVP－K30，美國國際特品公司）；交聯(lián)聚維酮（PVPP，德國BASF公司）；交聯(lián)羧甲基纖維素鈉（安徽山河藥用輔料有限公司）；甲基纖維素（浙江海申化工有限公司）；微粉硅膠（上海昌為醫(yī)藥輔料技術(shù)有限公司）；硬脂酸鎂（海鹽六和淀粉化工有限公司）；聚乙二醇（PEG）6000（上海市高南化工廠）。乙酸鈉、冰乙酸、氫氧化鈉等其他試劑均為分析純（上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。奈韋拉平／齊多夫定／拉米夫定復(fù)方片劑［每片含奈韋拉平、齊多夫定、拉米夫定分別為200、300、150mg，批號111101、111102、111103，上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院藥物制劑（設(shè)備與工藝）研究所自制］。

2 方法和結(jié)果

2.1 溶液的配制（1）試劑溶液 pH 1鹽酸溶液：取濃鹽酸9ml，加水稀釋至1000ml，即得。pH 4.5乙酸鹽緩沖液：取乙酸鈉2.99g、冰乙酸1.6ml，加水稀釋至1000ml，即得。pH 6.8磷酸鹽緩沖液：取0.2mol／L磷酸二氫鉀溶液250ml，0.2mol／L氫氧化鈉溶液118ml，加水稀釋至1000ml，即得。流動(dòng)相A：0.05mol／L乙酸銨溶液［用乙酸調(diào)節(jié)pH值（3.0±0.1）］與甲醇按95∶5比例配制即得。（2）藥物對照品溶液 精密稱取奈韋拉平對照品50.0mg、齊多夫定對照品75.0mg、拉米夫定對照品37.5mg，置100ml容量瓶中，加入20ml甲醇和60ml流動(dòng)相A，超聲溶解，放冷至室溫，用流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻。精密量取10ml，置25ml容量瓶中，用流動(dòng)相A稀釋至刻度，得到對照品溶液。（3）樣品溶液 取奈韋拉平／齊多夫定／拉米夫定復(fù)方片劑粉末適量（約含奈韋拉平50mg、齊多夫定75mg、拉米夫定37.5mg），置100ml容量瓶中，余同（2）藥物對照品溶液操作。過濾，取續(xù)濾液10ml，置25ml容量瓶中，用流動(dòng)相A稀釋至刻度，作為樣品溶液。制備不含3種主藥的片劑作為陰性對照樣品，同法制備得到陰性對照樣品溶液。（4）用于有關(guān)物質(zhì)含量測定的供試品溶液 將復(fù)方片劑5片磨成細(xì)粉，取細(xì)粉約100mg（相當(dāng)于含奈韋拉平26mg、齊多夫定39mg、拉米夫定19.5mg），置50ml容量瓶中，加5ml甲醇和適量流動(dòng)相A，強(qiáng)力振搖2min，超聲5min，放冷，再用流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，濾過，得到用于有關(guān)物質(zhì)含量測定的供試品溶液。（5）用于有關(guān)物質(zhì)含量測定的對照品溶液 精密量取1ml用于有關(guān)物質(zhì)含量測定的供試品溶液，置100ml容量瓶中，加流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，濾過，得到用于有關(guān)物質(zhì)含量測定的對照品溶液。

2.2 含量測定及有關(guān)物質(zhì)檢查（1）色譜條件：Welchrom－C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；采用梯度洗脫，流動(dòng)相A按2.1項(xiàng)（1）下方法配制，流動(dòng)相 B為甲醇，0～15min，A 相100%，15～65min，A 相 100% →60%，65～70min，A 相60%→0%，70～75min，A 相0%→100%，75～80min，A 相100%。流速1.0ml／min；檢測波長277nm；進(jìn)樣量20μl。（2）系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)：取2.1項(xiàng)的陰性對照樣品溶液、藥物對照品溶液和樣品溶液分別進(jìn)樣測定，得到色譜圖見圖1。理論塔板數(shù)按奈韋拉平、齊多夫定、拉米夫定峰計(jì)均≥2000，主峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度＞1.5。該色譜條件下，片劑中各輔料對3種主藥檢測無干擾，峰形良好，拉米夫定、齊多夫定、奈韋拉平保留時(shí)間分別約為14、34、48min。（3）含量測定方法考察：奈韋拉平濃度在57.2～472.8μg／ml、齊多夫定濃度在101.2～586.3μg／ml、拉米夫定濃度在86.5～397.4μg／ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系，日內(nèi)和日間RSD均＜0.5%，相對回收率為97.3%～102.2%（見表1）。（4）藥物含量測定：分別量取2.1項(xiàng)的樣品溶液和對照品溶液20μl，按上述色譜條件進(jìn)樣測定，用外標(biāo)法計(jì)算奈韋拉平、齊多夫定和拉米夫定的含量。（5）有關(guān)物質(zhì)含量測定：分別量取2.1項(xiàng)（4）、（5）用于有關(guān)物質(zhì)含量測定的供試品溶液和對照品溶液20μl，按上述色譜條件進(jìn)樣測定。測量供試品溶液色譜圖中雜質(zhì)峰峰面積之和（扣除系統(tǒng)溶劑峰和輔料峰），將其與對照品溶液峰面積比較，采用主成分自身對照法計(jì)算得到有關(guān)物質(zhì)含量。

圖1 奈韋拉平／齊多夫定／拉米夫定復(fù)方片劑的HPLC譜圖Figure 1 HPLC photograms of compound nevirapine－zidovudine－lamivudine tablets

表1 含量測定方法學(xué)考察結(jié)果Table 1 The results of methodology investigation of content determination

2.3 溶出度測定 取復(fù)方片劑6份，按《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄ⅩC第二法檢測藥片在不同溶出介質(zhì)中的溶出曲線。分別以1000ml的pH 1鹽酸溶液、水、pH 4.5乙酸鹽緩沖液和pH 6.8磷酸鹽緩沖液為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速75r／min，分別于0、5、10、15、30、45min取溶出液10ml，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液20μl，按2.2項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定。取奈韋拉平對照品20.0mg、齊多夫定對照品30.0mg、拉米夫定對照品15.0mg，置100ml容量瓶中，加相應(yīng)的溶出介質(zhì)適量，強(qiáng)力振搖2min，超聲5min，放冷，再用溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，同法濾過，測定峰面積。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算各取樣時(shí)間點(diǎn)奈韋拉平、齊多夫定、拉米夫定的溶出量，繪制溶出曲線。

2.4 休止角和崩解時(shí)限測定 按文獻(xiàn)［7］的方法測定壓片所用粉末的休止角，以評價(jià)流動(dòng)性。按《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄ⅩA的方法，取復(fù)方片劑6片分別置吊籃的玻璃管中，啟動(dòng)崩解儀，測定片劑的崩解時(shí)限。

2.5 脆碎度和硬度測定 按《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄ⅩG的方法，取復(fù)方片劑10片，精密稱重后置于脆碎度檢查儀圓筒中，轉(zhuǎn)動(dòng)100次。取出，除去粉末，精密稱重，根據(jù)減失重量計(jì)算片劑的脆碎度。用硬度計(jì)測定片劑的硬度。

2.6 復(fù)方片劑的制備

2.6.1 根據(jù)影響因素實(shí)驗(yàn)篩選輔料 取奈韋拉平、齊多夫定、拉米夫定原料藥，分別與微晶纖維素、乳糖、預(yù)膠化淀粉、甲基纖維素、羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、交聯(lián)聚維酮、PVP－K30、硬脂酸鎂、微粉硅膠、PEG 6000等輔料兩兩混勻，將粉末直接壓制成片后分別放置在60℃隔水式恒溫培養(yǎng)箱、低溫光照儀和內(nèi)置有飽和硝酸鉀溶液的干燥器內(nèi)進(jìn)行高溫（60℃）、強(qiáng)光照射（光照強(qiáng)度為4500lx）和高濕（25℃，相對濕度90%）影響因素實(shí)驗(yàn)。分別于0、5、10d取樣，按2.1項(xiàng)（5）的主成分自身對照法測定有關(guān)物質(zhì)含量的變化，結(jié)果見表2。另取奈韋拉平、齊多夫定、拉米夫定原料藥，按1∶1∶1混勻，將粉末直接壓制成片劑，進(jìn)行高溫、高濕和強(qiáng)光照射影響因素實(shí)驗(yàn)以測定原料藥的相容性。

影響因素實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，齊多夫定與各輔料在強(qiáng)光照射下，以及與微晶纖維素、交聯(lián)聚維酮在高濕條件下有關(guān)物質(zhì)含量上升較快。拉米夫定與PVP－K30、交聯(lián)聚維酮在高溫、高濕條件下有關(guān)物質(zhì)含量上升較快。因此初步確定制劑工藝應(yīng)在避光條件下進(jìn)行，填充劑避免使用微晶纖維素，黏合劑避免使用PVP－K30，崩解劑避免使用交聯(lián)聚維酮。確定復(fù)方片劑的填充劑使用乳糖和預(yù)膠化淀粉，黏合劑使用甲基纖維素，崩解劑使用羧甲基淀粉鈉和交聯(lián)羧甲基纖維素鈉，潤滑劑使用硬脂酸鎂、微粉硅膠和PEG 6000。

2.6.2 片劑的制備及性質(zhì)考察 將奈韋拉平、齊多夫定、拉米夫定原料藥和輔料分別過80目篩，按表3中的處方配比混合均勻。用干法制粒機(jī)制粒，進(jìn)料轉(zhuǎn)速12Hz，滾輪轉(zhuǎn)速14Hz，主輪壓力14kPa，側(cè)封壓力14kPa，顆粒經(jīng)20目篩網(wǎng)整粒后壓片，即得白色的復(fù)方片劑。在制備顆粒和壓片過程中拉上窗簾，關(guān)閉室內(nèi)日光燈，制片的環(huán)境相對濕度控制在≤60%。測定各處方組成制備的顆粒的休止角，片劑的硬度、脆碎度、崩解時(shí)限、有關(guān)物質(zhì)及藥物含量，結(jié)果見表4。測定不同處方組成的片劑在不同溶出介質(zhì)中的溶出曲線，見圖2。

表2 不同輔料對影響因素實(shí)驗(yàn)中有關(guān)物質(zhì)含量的影響Table 2 Effects of various excipients on contents of related substances in influencing factor tests（%）

表3 奈韋拉平／齊多夫定／拉米夫定復(fù)方片劑的處方設(shè)計(jì)Table 3 Formula design of compound nevirapine－zidovudine－lamivudine tablets

由表4可見，各處方組成的顆粒流動(dòng)性均較好，片劑崩解時(shí)限≤15min，硬度、脆碎度及有關(guān)物質(zhì)含量等質(zhì)量指標(biāo)較好。但是由圖2可見，不同處方組成的片劑在不同溶出介質(zhì)中的溶出曲線有較大差異。處方5和6中的藥物在各溶出介質(zhì)中溶出度均較好，30min內(nèi)各主藥溶出度＞80%。相比較而言，按處方6制備的片劑硬度和脆碎度綜合評價(jià)較好，因此確定以處方6作為最優(yōu)處方。

表4 不同處方組成片劑的性質(zhì)考察Table 4 Properties of tablets with different formulae

圖2 不同處方制備的奈韋拉平／齊多夫定／拉米夫定復(fù)方片劑在不同溶出介質(zhì)中的溶出曲線Figure 2 Dissolution curves of compound nevirapine－zidovudine－lamivudine tablets prepared based on different formulae in different dissolvants

2.7 片劑的試制及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 按處方6和2.6.2項(xiàng)方法制備奈韋拉平／齊多夫定／拉米夫定復(fù)方片劑3批，進(jìn)行影響因素實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表5。片劑經(jīng)鋁塑包裝后，進(jìn)行加速實(shí)驗(yàn)考察［溫度（40±2）℃，相對濕度75%］。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3批樣品經(jīng)過6個(gè)月的加速實(shí)驗(yàn)，其性狀、藥物含量、有關(guān)物質(zhì)含量等質(zhì)量指標(biāo)未見顯著變化，因此確定處方6制備的片劑各項(xiàng)指標(biāo)合格，穩(wěn)定性良好。

表5 按處方6制備的片劑的影響因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of influencing factor tests of tablets prepared based on formula 6（%）

3 討 論

篩選片劑的處方組成，首先應(yīng)根據(jù)原輔料的相容性研究結(jié)果選擇適宜的輔料。各輔料的配比和用量除了與顆粒流動(dòng)性、片劑的硬度、脆碎度、崩解時(shí)限等質(zhì)量指標(biāo)緊密聯(lián)系之外，還影響藥物在溶出介質(zhì)中的溶出度。在處方篩選過程中，比較藥物在多種溶出介質(zhì)中的溶出曲線是非常重要的考察項(xiàng)目。對于溶解度受pH值影響大、低溶解性的藥物，處方組成對藥物的溶出度影響較大。奈韋拉平屬于低溶解性藥物，不同處方組成片劑中的奈韋拉平溶出度差異較大。PEG 6000在處方中既作潤滑劑，又因其親水性而加快水分對片劑的濕潤，可以顯著增加奈韋拉平的溶出度。復(fù)方片劑的成分比較復(fù)雜，作者在篩選處方前考察了原料藥與輔料在高濕、高溫、強(qiáng)光照射等條件下的穩(wěn)定性，從而選擇了合適的輔料，采用干法制粒技術(shù)，制備了質(zhì)量穩(wěn)定的奈韋拉平／齊多夫定／拉米夫定復(fù)方片劑，值得進(jìn)一步開發(fā)。

［1］Cook J E，Dasgupta S，Middaugh L D，etal.Highly active antiretroviral therapy and human immunodeficiency virus encephalitis［J］.Ann Neurol，2005，57（6）：795－803.

［2］陳諧捷，唐小平.艾滋病高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療［J］.中華全科醫(yī)師雜志，2006，5（11）：659－661.Chen XieJie，Tang XiaoPing.Highly active antiretroviral therapy to AIDS［J］.Chin J Gen Pract，2006，5（11）：659－661.In Chinese.

［3］De Clercq E.New developments in anti－HIV chemotherapy［J］.IL Farmaco，2001，56（1－2）：3－12.

［4］De Clercq E.Anti－HIV drugs：25compounds approved within 25years after the discovery of HIV［J］.Int J Antimicrob Agents，2009，33（4）：307－320.

［5］吳意紅，張 丹，毛惠英，等.HPLC測定拉米夫定中的右旋異構(gòu)體［J］.華西藥學(xué)雜志，2009，24（1）：80－81.Wu YiHong，Zhang Dan，Mao HuiYing，etal.Determination of dextroisomer in lamivudine by HPLC［J］.West China J Pharm Sci，2009，24（1）：80－81.In Chinese with English abstract.

［6］彭水芳，沈衛(wèi)陽，胡育筑.RP－HPLC檢查奈韋拉平中有關(guān)物質(zhì)及其片劑的含量測定［J］.中國藥學(xué)雜志，2007，42（20）：1582－1584.Peng ShuiFang，Shen WeiYang，Hu YuZhu.Determination of nevirapine and isolation of related substances in nevirapine tablets by RP－HPLC［J］.Chin Pharm J，2007，42（20）：1582－1584.In Chinese with English abstract.

［7］張海英，劉 飛.超微粉研對羅勒顯微特征及總黃酮體外溶出的影響［J］.藥學(xué)服務(wù)與研究，2014，14（1）：35－38.Zhang HaiYing，Liu Fei.Effects of ultramicro pulverization on the microscopic characteristics ofQcimumbacilicumand on theinvitrodissolution of total flavone［J］.Pharm Care Res，2014，14（1）：35－38.In Chinese with English abstract.