王玉亮，王澤劍，殷 明＊，辛海量

（1.上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海200240；2.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院植物生物技術(shù)研究中心，上海200240；3.第二軍醫(yī)大學(xué)中醫(yī)系，上海200433）

［本文編輯］陽(yáng)凌燕

青蒿琥酯是青蒿素的重要衍生物之一，與青蒿素相比，不僅效價(jià)高、毒性小，而且溶解性好，更有利于臨床應(yīng)用［1］。青蒿琥酯不僅具有很好的抗瘧疾作用，而且還具有治療寄生蟲(chóng)?。?］、抗腫瘤［3］、抗炎和免疫調(diào)節(jié)［4］等多種作用。熊果酸又名烏索酸（烏蘇酸），屬五環(huán)三萜類化合物，在自然界分布很廣，如存在于杜鵑花科植物熊果的葉和果實(shí)中，玄參科植物毛泡桐的葉中，以及木樨科植物女貞的葉中。熊果酸具有廣泛的生物活性，包括抗癌、降血脂、對(duì)肝損傷的保護(hù)、抗菌消炎和抗病毒等作用［5］。作者的前期實(shí)驗(yàn)研究表明，青蒿琥酯和熊果酸復(fù)方可有效降低模型動(dòng)物血清中三酰甘油和膽固醇的水平［6］，具備開(kāi)發(fā)成一種新型降脂復(fù)方藥物的潛力。本研究對(duì)青蒿琥酯和熊果酸復(fù)方進(jìn)行了普通藥理學(xué)和初步的毒性實(shí)驗(yàn)研究，為該復(fù)方的進(jìn)一步研發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試品及其配制 青蒿琥酯（含量98.5%，批號(hào)000129，廣州漢方藥業(yè)）；熊果酸（含量98.6%，批號(hào)XC091225，西安小草植物科技有限責(zé)任公司）。配制方法：吐溫助溶，溶于生理鹽水，配成所需的濃度。

1.2 動(dòng)物和儀器 ICR小鼠和SD大鼠由復(fù)旦大學(xué)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK滬2009－0019，雌雄兼用。轉(zhuǎn)棒儀（山東益延醫(yī)療器械公司）；AT－738PLUS生化分析儀（上海安泰分析儀器有限公司）；血常規(guī)分析儀（日本Nihon Kohden公司）；JA1003N電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；MPA－2000M型多道生物信號(hào)分析系統(tǒng)（上海奧爾科特生物科技有限公司）。

2 方法和結(jié)果

2.1 對(duì)小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響

2.1.1 動(dòng)物分組及給藥劑量 實(shí)驗(yàn)前稱重小鼠，按體重編號(hào)，應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表，完全隨機(jī)化分為6組，分別灌胃給藥：對(duì)照組給予生理鹽水；青蒿琥酯組給予青蒿琥酯50mg／kg；熊果酸組給予熊果酸50mg／kg；復(fù)方低、中、高劑量組分別給予25、50、100mg／kg復(fù)方（青蒿琥酯∶熊果酸＝1∶1）。

2.1.2 對(duì)小鼠一般行為表現(xiàn)的影響 ICR小鼠60只，按體重隨機(jī)分為6組。按2.1.1項(xiàng)分組情況給藥，給藥容量均為10ml／kg，分別同法觀察和記錄給藥前、給藥后15、30、60、120、180min各組小鼠的一般行為表現(xiàn)，如瞳孔變化、姿勢(shì)、步態(tài)，有無(wú)流涎、肌顫等情況。結(jié)果表明，給藥后15、30、60、120、180min，各組小鼠的一般行為表現(xiàn)，如瞳孔、姿勢(shì)、步態(tài)無(wú)異常情況，無(wú)流涎、肌顫等現(xiàn)象。

2.1.3 開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)觀察對(duì)小鼠自主活動(dòng)的影響 ICR小鼠60只，按2.1.1項(xiàng)方法分組，灌胃給藥后，0.5、1、2、4h進(jìn)行開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)測(cè)試，共4次。觀察并記錄小鼠在5min內(nèi)活動(dòng)總路程、平均速度和中央活動(dòng)時(shí)間。結(jié)果顯示，青蒿琥酯對(duì)小鼠自主活動(dòng)無(wú)影響，熊果酸組和復(fù)方組均可提高小鼠活動(dòng)的總路程，顯示對(duì)中樞神經(jīng)有一定的興奮作用（見(jiàn)表1），但對(duì)平均速度和中央活動(dòng)時(shí)間無(wú)影響。

表1 開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)總路程結(jié)果Table 1 The results of overall length of open－field test（n＝10，l／cm）

2.1.4 對(duì)戊巴比妥鈉閾劑量致小鼠睡眠時(shí)間的影響 ICR小鼠60只，按2.1.1項(xiàng)分組，灌胃給藥后0.5h開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)在22～24℃條件下進(jìn)行。小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉水溶液（50mg／kg）。以翻正反射消失至恢復(fù)活動(dòng)時(shí)間作為睡眠時(shí)間，觀察并記錄其數(shù)值。戊巴比妥閾劑量致小鼠睡眠時(shí)間分別為：對(duì)照組（158±19）s，青蒿琥酯組（148±50）s，熊果酸組（188±55）s，復(fù)方低劑量組（182±41）s，復(fù)方中劑量組（179±42）s，復(fù)方高劑量組（160±58）s，各組間無(wú)顯著差異，表明青蒿琥酯和熊果酸對(duì)戊巴比妥閾劑量致小鼠睡眠時(shí)間無(wú)顯著影響。

2.1.5 對(duì)小鼠機(jī)體協(xié)調(diào)能力的影響 ICR小鼠60只，隨機(jī)分為6組。轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)在22～24℃條件下進(jìn)行。轉(zhuǎn)速為25r／min，各組動(dòng)物分別灌胃給藥后1h開(kāi)始檢測(cè)，測(cè)定每只小鼠在勻速轉(zhuǎn)動(dòng)木棍上停留的時(shí)間，每只測(cè)定3次，取其平均值。轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組間無(wú)顯著差異，表明青蒿琥酯和熊果酸對(duì)小鼠的機(jī)體協(xié)調(diào)能力均無(wú)顯著影響。

2.2 對(duì)大鼠呼吸和心血管系統(tǒng)的影響 實(shí)驗(yàn)在（24±2）℃下進(jìn)行。SD大鼠60只，雌雄兼用，稱重后按體重編號(hào)，應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表分為6組。禁食6h后，腹腔注射1200mg／kg 20%烏拉坦麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，切開(kāi)頸部皮膚，分離頸總動(dòng)脈并插管，再連接壓力傳感器測(cè)血壓，氣管插管連接到張力傳感器測(cè)定呼吸頻率及幅度，四肢插針形電極測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖；傳感器及針型電極再與連接到計(jì)算機(jī)上的多功能生物信號(hào)分析系統(tǒng)連接，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)血壓（平均動(dòng)脈壓），心率，呼吸頻率、幅度，以及標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖。手術(shù)結(jié)束后穩(wěn)定30min，記錄各項(xiàng)數(shù)據(jù)，然后給藥：分別灌胃給予青蒿琥酯和熊果酸復(fù)方溶液（70、35、17.5mg／kg），青蒿琥酯溶液（35mg／kg），熊果酸溶液（35mg／kg）或0.9%氯化鈉注射液，給藥容積均為1ml／只，在給藥后0.5、1、2及4h記錄存儲(chǔ)數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，青蒿琥酯、熊果酸及其復(fù)方各劑量組對(duì)大鼠呼吸系統(tǒng)無(wú)影響，對(duì)血壓和心電圖波形無(wú)影響。

2.3 初步毒性實(shí)驗(yàn)

2.3.1 小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn) ICR小鼠40只，雌雄各半，給藥劑量為2g／kg（青蒿琥酯∶熊果酸＝1∶1），實(shí)驗(yàn)前禁食8h，給藥后連續(xù)觀察小鼠反應(yīng)，并記錄1、2、4h，1、2、3～14d等時(shí)間內(nèi)小鼠死亡數(shù)，并對(duì)死亡小鼠進(jìn)行解剖，觀察主要臟器情況，存活小鼠在第14天進(jìn)行解剖。結(jié)果顯示，灌胃給予青蒿琥酯和熊果酸復(fù)方2g／kg后，小鼠出現(xiàn)趴下、靜臥、運(yùn)動(dòng)能力減退癥狀，4h后癥狀逐漸緩解，恢復(fù)正常。14d內(nèi)未見(jiàn)小鼠死亡和毒副反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后尸檢，肉眼未見(jiàn)明顯病理改變。

2.3.2 大鼠1個(gè)月初步毒性實(shí)驗(yàn) SD大鼠60只，雌雄各半，按體重隨機(jī)分為3組：對(duì)照組給予生理鹽水；復(fù)方低、高劑量組分別給予100、400mg／kg復(fù)方（青蒿琥酯∶熊果酸＝1∶1）。給藥1個(gè)月，在末次給藥后，禁食12h，不禁水，麻醉后腹腔動(dòng)脈取血5ml供檢測(cè)用。稱量體重，摘取大鼠的主要臟器（心、肝、脾、肺、腎、腦、腎上腺、胃、胸腺、子宮、卵巢、睪丸、膀胱、前列腺），稱量，根據(jù)體重和臟器重量計(jì)算臟器系數(shù)。經(jīng)過(guò)1個(gè)月的長(zhǎng)期給藥，大鼠的血常規(guī)和血生化中多項(xiàng)數(shù)據(jù)與正常對(duì)照組比較有顯著性差異（見(jiàn)表2、3），堿性磷酸酶、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的升高表明給藥組大鼠肝功能受到一定損傷，但經(jīng)過(guò)兩周恢復(fù)后，血常規(guī)和血生化各項(xiàng)指標(biāo)都恢復(fù)正常（相關(guān)數(shù)據(jù)未列出），顯示該損傷是可逆的。主要臟器病理切片結(jié)果也表明給藥組大鼠各器官無(wú)實(shí)質(zhì)性損傷。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

表2 大鼠一個(gè)月初步毒性實(shí)驗(yàn)中部分血常規(guī)數(shù)據(jù)Table 2 Some blood routine data in preliminary toxicity test for one month in rats（n＝8）

表3 大鼠1個(gè)月初步毒性實(shí)驗(yàn)中部分血生化數(shù)據(jù)Table 3 Some biochemical data in preliminary toxicity test for one month in rats（n＝8）

3 討 論

普通藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，青蒿琥酯和熊果酸復(fù)方對(duì)大鼠呼吸和心血管系統(tǒng)無(wú)明顯影響。在研究對(duì)小鼠神經(jīng)系統(tǒng)影響的實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)和戊巴比妥閾劑量致小鼠睡眠實(shí)驗(yàn)中各組間也無(wú)顯著差異，只有在開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中青蒿琥酯和熊果酸復(fù)方能顯著增加小鼠運(yùn)動(dòng)的總路程，與正常對(duì)照組比較有顯著性差異，顯示出一定的中樞神經(jīng)興奮作用。運(yùn)動(dòng)量的增加有利于血脂水平的降低，該藥理作用與其降血脂的主要藥效可能有一定的關(guān)聯(lián)。

通過(guò)初步的急性毒性和長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)表明，青蒿琥酯和熊果酸在實(shí)驗(yàn)劑量中未有明顯的毒副作用，長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)中對(duì)血生化和血常規(guī)指標(biāo)有一定的影響，但均可通過(guò)停藥恢復(fù)。該結(jié)果為下一步正規(guī)的毒性實(shí)驗(yàn)中劑量的設(shè)定提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］Li Y，Wu Y L.An over four millennium story behind qinghao－su（artemisinin）—a fantastic antimalarial drug from a traditional Chinese herb［J］.Curr Med Chem，2003，10（21）：2197－2230.

［2］Hua HaiYong，Liang YouSheng，Zhang Yan，etal.The sensitivity of artesunate againstSchistosomajaponicumdecreased after 10years of use in China［J］.Parasitol Res，2010，107（4）：873－878.

［3］Crespo－Ortiz M P，Wei M Q.Antitumor activity of artemisinin and its derivatives：from a well－known antimalarial agent to a potential anticancer drug［J］.J Biomed Biotechnol，2012，2012：247597.

［4］Yang Z，Ding J，Yang C，etal.Immunomodulatory and antiinflammatory properties of artesunate in experimental colitis［J］.Curr Med Chem，2012，19（26）：4541－4551.

［5］Ikeda Y，Murakami A，Ohigashi H.Ursolic acid：an anti－and pro－inflammatory triterpenoid［J］.Mol Nutr Food Res，2008，52（1）：26－42.

［6］唐克軒，王玉亮，辛海量.降血脂的中藥組合物及其制備方法：中國(guó)，CN101507727［P］.2009－08－19.Tang KeXuan，Wang YuLiang，Xin HaiLiang.Hypolipidemic traditional Chinese herb composition and its preparation methods：China，CN101507727［P］.2009－08－19.In Chinese.