郭利華，邵曉娜，朱華陀，陳文果，李 嵐，虞朝輝，陳李華

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，浙江杭州310003)

1α，25(OH)2D3對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有潛在的抗增殖作用，流行病學(xué)以及細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)活性維生素D3可以調(diào)節(jié)結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌細(xì)胞周期、細(xì)胞侵襲、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞分化的作用［1－3］。1α，25(OH)2D3的目的基因包括細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子P21、P27、cyclins、細(xì)胞間黏附、侵襲抑制因子以及編碼細(xì)胞骨架蛋白等［4］。本研究的目的是觀察1α，25(OH)2D3對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期的影響，闡述1α，25(OH)2D3發(fā)揮抗增殖作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人胃癌細(xì)胞系BGC-823和SGC-7901細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù));RPMI 1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶和澳洲胎牛血清(Gibco公司);1α，25(OH)2D3、MTT和DMSO(Sigma公司);Trizol、PI染料和 RNA酶(Sangon公司);PrimeScriptTMRT Master Mix和SYBR? PrimeScriptTM(Takara公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

采用含10%牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)BGC-823、SGC-7901人胃癌細(xì)胞系，在37℃，含5%CO2、濕度100%恒溫孵育箱中培養(yǎng)。2～3 d后，加2 mL 0.25%胰蛋白酶消化3 min，加等體積的培養(yǎng)液終止消化，1 000×g離心5 min。

1.3 MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)

細(xì)胞以2 000個(gè)/孔種植于96孔板，4 h后，各組細(xì)胞加入不同濃度的1α，25(OH)2D3(1 ×10－10、1×10－9、1×10－8和 1 ×10－7mol/L)并設(shè)置陰性對(duì)照，每組4個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，每孔加20μL的MTT(5 g/L)，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h;吸取上清，每孔加150μL DMSO，室溫下?lián)u床上搖晃10 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm的A值。計(jì)算生長(zhǎng)抑制率=［(A實(shí)驗(yàn)組－A對(duì)照組)/A對(duì)照組］×100%。

1.4 細(xì)胞周期檢測(cè)

將BGC-823和SGC-7901細(xì)胞用無(wú)血清的培養(yǎng)基以(4～5)×105個(gè)/孔鋪于6孔板，24 h后更換含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，加入終濃度為100 nmol/L的1α，25(OH)2D3，對(duì)照組加入等量的 RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。細(xì)胞用0.5%胰蛋白酶消化，接著用PBS洗2次，每次1 000×g離心5 min;棄上清后用預(yù)冷的70%乙醇固定，4℃過(guò)夜;離心除去乙醇，PBS洗滌2次，然后加5uL的RNA酶(5 g/L)，室溫下處理15 min;每管加5μL的PI(5 g/L)染料，室溫避光孵育30 min;1 h內(nèi)流式檢測(cè)。應(yīng)用ModFit LTTM軟件分析細(xì)胞周期結(jié)果。

1.5 RT-qPCR

將BGC-823和SGC-7901細(xì)胞鋪于6孔板，實(shí)驗(yàn)組加100 nmol/L 1α，25(OH)2D3繼續(xù)培養(yǎng)，72 h之后，吸去培養(yǎng)基，每孔加1 mL Trizol(BBI)抽提Total RNA，采用NanoDrop? ND-2000測(cè)定RNA濃度和純度，根據(jù)RNA濃度結(jié)果將各組調(diào)成一致的濃度，再應(yīng)用 RT試劑(Takara)將 RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。定量PCR引物如下:內(nèi)參GAPDH引物:上游 5'-TCAACGACCACTTTGTCAAGCTCA-3'，下游 5'-GCTGGTGGTCCAGGGGTCTTACT-3';P21引物:上游5'-AGGAAGACCATGTGGACCTGTCAC-3'，下游 5'-A CCAAATGCGTGTCCTCAGAGT-3';cyclin E1引物:上游 5'-GCAGTATCCCCAGCAAATC-3'，下游 5'-TCAA GGCAGTCAACATCCA-3';cyclin D1引物:上游5'-GCTGTGCATCTACACCGACAACTC-3'，下游 5'-AGG TTCCACTTGAGCTTGTTCACC-3';CDK6引物:上游5'-ATATCTGCCTACAGTGCCCTGTCTC-3'，下游 5'-G TGGGAATCCAGGTTTTCTTTGCAC-3'。定量PCR反應(yīng)條件是:95℃預(yù)熱2 min，95℃解鏈10 s，擴(kuò)增:40循環(huán)95℃/10 s，60℃/34 s，72℃/15 s;擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，按95℃/10 s;60℃/60 s;95℃/15 s的反應(yīng)條件建立PCR產(chǎn)物熔解曲線;數(shù)據(jù)采用2－△△CT法進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不同濃度間比較采用方差分析，多組間比較采用LSD分析。

2 結(jié)果

2.1 1α，25(OH)2D3 抑制 BGC-823、SGC-7901增殖

1×10－10～1×10－7mol/L 的1α，25(OH)2D3對(duì)BGC-823和SGC-7901胃癌細(xì)胞增殖均具有一定的劑量依耐性，不同濃度的1α，25(OH)2D3對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用程度不同，而且隨濃度升高抑制作用逐漸增強(qiáng)。1×10－8和1×10－7mol/L對(duì) BGC-823和SGC-7901細(xì)胞增殖抑制率高于1×10－10mol/L(p＜0.05)(表1)。

2.2 1α，25(OH)2D3對(duì)胃癌細(xì)胞周期的影響

10－7mol/L 1α，25(OH)2D3干預(yù)胃癌細(xì)胞系72 h之后，流式細(xì)胞術(shù) (flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況，G0/G1期細(xì)胞比例較對(duì)照組明顯增加(p＜0.05)，S期細(xì)胞比例下降(p＜0.05)，G2/M期細(xì)胞比例減少(p＜0.05)(表2，圖1)。

2.3 RT-qPCR檢測(cè)1α，25(OH)2 D3對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)的影響

1×10－7mol/L 1α，25(OH)2D3處理 BGC-823和SGC-7901胃癌細(xì)胞72 h后，P21 mRNA表達(dá)升高，而cyclin D1、cyclin E1和CDK6 mRNA表達(dá)降低(p＜0.05)(圖2)。

3 討論

1α，25(OH)2D3是維生素D最主要的活性形式，近年來(lái)的流行病學(xué)研究數(shù)據(jù)表明血清25OHD水平與一些惡性腫瘤發(fā)病率呈負(fù)相關(guān)［5］;而且大量體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究證明，1α，25(OH)2D3對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等活動(dòng)具有一定程度地調(diào)節(jié)作用［6］。1α，25(OH)2D3結(jié)合到維生素 D 受體VDR，激活的VDR與維甲酸X受體(Retinoid X Receptor，RXR)形成VDR/RXR共因子，它結(jié)合到目的基因維生素D反應(yīng)元件啟動(dòng)子區(qū)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄［7］。

表1 MTT法檢測(cè)1α，25(OH)2 D3對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響Table 1 The effect of 1α，25(OH)2D3 on gastric cancer cells proliferation was detected via MTT assay，n=3)

表1 MTT法檢測(cè)1α，25(OH)2 D3對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響Table 1 The effect of 1α，25(OH)2D3 on gastric cancer cells proliferation was detected via MTT assay，n=3)

＊P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 compared with control group．

BGC-823 group SGC-7901 A490 nm inhibitor rate A490 nm inhibitor rate control 0.636±0.016 0.663±0.084 1×10－10 mol/L 0.567±0.025* 10.7% 0.603±0.039* 15.3%1×10－9 mol/L 0.561±0.015* 11.7% 0.589±0.036* 17.3%1×10－8 mol/L 0.523±0.031* 17.8%* 0.530±0.061＊＊ 25.5%＊＊1×10－7 mol/L 0.483±0.016＊＊ 24.0%＊＊ 0.462±0.0318＊＊ 35.2%＊＊

，n=3)表2 1，25(OH)2 D3對(duì)細(xì)胞周期的影響Table 2 The effect of 1α，25(OH)2 D3 on cell cycle

，n=3)表2 1，25(OH)2 D3對(duì)細(xì)胞周期的影響Table 2 The effect of 1α，25(OH)2 D3 on cell cycle

＊P ＜0.05 compared with control group．

cell lines group G0/G1 rate(%) Srate(%) G2/M rate(%)BGC-823 control 53.69±1.44 31.69±0.56 14.61±1.16 1，25D3 66.56±0.76* 24.17±1.25* 9.27±1.78*SGC-7901 control 69.38±0.64 23.14±0.96 7.48±0.87 1，25D3 77.29±1.33* 14.89±0.85* 8.49±0.79*

圖1 流式檢測(cè)1α，25(OH)2 D3對(duì)細(xì)胞周期的影響Fig 1 The effect of 1α，25(OH)2 D3 on the cell cycle was detected via Flow cytometry

圖2 1α，25(OH)2 D3對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響Fig 2 The effect of 1α，25(OH)2 D3 on cell cycle-related genes mRNA expression，n=3)

1α，25(OH)2D3顯著性抑制胃癌細(xì)胞增殖，并呈現(xiàn)濃度依賴性，1α，25(OH)2D3引起 BGC-823、SGC-7901胃癌細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例減少。細(xì)胞周期結(jié)果表明1α，25(OH)2D3使細(xì)胞主要分布于DNA靜止期G0/G1期，阻止其進(jìn)入S期，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，結(jié)果導(dǎo)致細(xì)胞周期延長(zhǎng)，從而使細(xì)胞增殖減慢。

細(xì)胞周期各個(gè)時(shí)期由不同細(xì)胞周期蛋白(cyclin)、周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)、CDK 抑制蛋白(cyclin-dependent kinase inhibitor，CKI)來(lái)調(diào)控所調(diào)控。正常細(xì)胞中，cyclin Dl與CDK4/CDK6先結(jié)合形成復(fù)合體，CDK4/CDK6發(fā)揮激酶活性使pRb磷酸化［8］，進(jìn)入S期必需的轉(zhuǎn)錄因子 E2F從 Rb-E2F復(fù)合體中解離［9］;這促進(jìn)cyclin E積累而刺激CDK2活性，從而激活另一些轉(zhuǎn)錄因子，使與DNA合成有關(guān)的基因表達(dá)，細(xì)胞即由G1期進(jìn)入 S 期［10］。細(xì)胞在 1α，25(OH)2D3干預(yù)下將降低細(xì)胞周期蛋白、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶表達(dá)阻礙細(xì)胞G1期進(jìn)入S期［11］。除了周期蛋白和磷酸化對(duì)CDK活性進(jìn)行調(diào)節(jié)外，CKI(如P2l)對(duì)CDK活性起負(fù)調(diào)控作用。P21能抑制包括cyclinE-CDK2在內(nèi)的多種G1期Cyclin-CDK激酶活性，使細(xì)胞不能通過(guò) G1期［12－14］。本研究中，胃癌細(xì)胞系 BGC-823、SGC-7901 在1α，25(OH)2D3干預(yù)后上調(diào) CDK抑制蛋白P21 mRNA水平，下調(diào)周期蛋白cyclin D1、cyclin E1，下調(diào)周期蛋白依賴性激酶CDK6 mRNA水平，導(dǎo)致細(xì)胞阻滯于G1/S檢測(cè)點(diǎn)，從而防止細(xì)胞過(guò)度增殖。

總之，本研究的結(jié)果提示1α，25(OH)2D3抗胃癌細(xì)胞增殖作用可能與其阻滯細(xì)胞周期、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。

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