薛建有，桑婷婷，戚武林，曹玲玲，毛群銓，朱曉芳，張世馥

目前已發(fā)現(xiàn)一些因子參與調(diào)控紅系分化。GATA1是一個(gè)至關(guān)重要的造血轉(zhuǎn)錄因子，GATA1/FOG1復(fù)合體通過(guò)激活α-珠蛋白和EKLF基因的表達(dá)而抑制GATA2的表達(dá)來(lái)促進(jìn)紅系分化［1］。PU.1與GATA1的作用恰好相反，可阻礙紅系分化。在HMBA或DMSO誘導(dǎo)分化的MEL細(xì)胞中GATA1表達(dá)上調(diào)而PU.1表達(dá)下調(diào)，GATA1的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致MEL細(xì)胞紅系分化，但這種GATA1的誘導(dǎo)作用可被PU.1的上調(diào)表達(dá)抑制［2］。PU.1與GATA1相結(jié)合導(dǎo)致GATA1級(jí)聯(lián)信號(hào)通路的阻斷而阻礙了紅系分化進(jìn)程。c-Myc在紅系分化過(guò)程中表達(dá)下調(diào)，其過(guò)表達(dá)阻礙Rac2和組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)Gcn5下調(diào)表達(dá)從而導(dǎo)致珠蛋白H3和H4乙酰化、阻礙了核固縮和排核［3］。真核生物翻譯起始因子 4H(eIF4H)最早在兔子網(wǎng)織紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，在eIF4B和eIF4F缺少的情況下可促進(jìn)血紅蛋白的合成［4］。然而eIF4H是否對(duì)白血病細(xì)胞增殖和紅系分化的產(chǎn)生影響尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究通過(guò)構(gòu)建eIF4H低表達(dá)的MEL細(xì)胞穩(wěn)定株，通過(guò)觀察eIF4H低表達(dá)對(duì)MEL細(xì)胞體外增殖和紅系分化的影響，為進(jìn)一步探究eIF4H在白血病發(fā)生中的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和質(zhì)粒

HEK293T細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)，MEL細(xì)胞(中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所惠贈(zèng))。

載體質(zhì)粒 pLKO.1、對(duì)照質(zhì)粒 pLKO.1-TRC(scramble)、包裝質(zhì)粒pCMV-VSVG和pCMV-dR8.2(Addgene公司)。

1.2 試劑

胎牛血清(Hyclone公司);MEN培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司);嘌呤霉素、丁酸鈉和MTT(Sigma公司);轉(zhuǎn)染試劑 LipofectanineTM2000(Invitrogen公司);PI凋亡染色試劑盒(南京凱基生物);兔抗小鼠eIF4H單克隆抗體(CST公司);小鼠抗人β-actin單克隆抗體和羊抗小鼠 IgG單克隆抗體(Sigma公司)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng):MEL和HEK29T細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液(100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素)中，于37℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)，每隔2 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 含shRNA干擾序列重組質(zhì)粒的構(gòu)建:設(shè)計(jì)的兩對(duì)eIF4H靶序列分別為eIF4H-shRNA-1:5'-GAGACAAAGACACAGACAAAT-3';eIF4H-shRNA-2:5'-ACTCGCACACCAACCTTATAT-3'。小發(fā)夾shRNA干擾片段經(jīng)退火后與pLKO.1-TCR質(zhì)粒載體鏈接。選取scramble-shRNA作為陰性對(duì)照，此序列在細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有靶向基因，對(duì)細(xì)胞的形態(tài)沒(méi)有影響，序列如下:5'-GCCAATCGTTCTCTGACAGAA-3'。

1.3.3 慢病毒包裝:HEK293T細(xì)胞按7×105/mL接種于10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過(guò)夜;再用無(wú)血清MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h，加入16μg質(zhì)粒(7.5μg pLKO.1，2.9 μg pCMV-VSVG，5.6 μg pCMV-dR8.2)和15μL LipofectanineTM2000，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，換成完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)96 h后，收集含有病毒的上清液，－80℃儲(chǔ)存。

1.3.4 eIF4H低表達(dá)的MEL細(xì)胞穩(wěn)定株的構(gòu)建:MEL細(xì)胞按每孔4 500個(gè)細(xì)胞接種于24孔板內(nèi)，加入1 mL DMEM培養(yǎng)基，將pLKO.1-scrambleshRNA(scramble-shRNA)、pLKO.1-eIF4H-shRNA-1(eIF4H-shRNA-1)和 pLKO.1-eIF4H-shRNA-2(eIF4H-shRNA-2)3種病毒分別加到細(xì)胞懸液中。侵染96 h后，棄去上清培養(yǎng)基，用0.5μg/mL的嘌呤霉素篩選含抗性基因的細(xì)胞。最后通過(guò)蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證eIF4H的表達(dá)情況。

1.3.5 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖:取各組細(xì)胞按3 000個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板中，每孔200μL。設(shè)置培養(yǎng)基空白對(duì)照組，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。于含5%CO2，37 ℃ 的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24、48、72、96和120 h后，每孔加入10μL 5 g/L的MTT溶液，避光孵育4 h后棄培養(yǎng)基，加入150μL DMSO，待紫色結(jié)晶充分溶解，A595nm處測(cè)定吸光度值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，A595nm為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)eIF4H低表達(dá)對(duì)MEL細(xì)胞周期的影響:收集各組細(xì)胞，PBS洗3次，70%乙醇固定至少24 h。根據(jù)凱基PI凋亡染色試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3.7 聯(lián)苯胺染色法檢測(cè)細(xì)胞的紅系分化情況:取各組細(xì)胞按1.5×104/mL接種于24孔板中，加入1.25 mmol/L誘導(dǎo)劑丁酸鈉，對(duì)照組不加藥。加藥后3～5 d分別取各組細(xì)胞進(jìn)行聯(lián)苯胺染色。收集細(xì)胞，1 000 r/min，離心3 min;棄上清，加入1 mL 0.9%氯化鈉注射液(0.85%)洗1次，去除殘留培養(yǎng)基;加入預(yù)混的聯(lián)苯胺染液:30%H2O2(50∶1，v∶v)100μL;滴片后鏡檢，統(tǒng)計(jì)聯(lián)苯胺陽(yáng)性細(xì)胞所占比例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 eIF4H蛋白低表達(dá)穩(wěn)定株的建立

圖1A和B顯示轉(zhuǎn)染效率較高。eIF4H基因通過(guò)選擇性的剪接5位外顯子產(chǎn)生兩個(gè)蛋白亞型，亞型Ⅰ約27 ku，亞型Ⅱ約25 ku。圖1 C顯示與對(duì)照組相比eIF4H-shRNA-2組eIF4H兩個(gè)亞型表達(dá)均下調(diào)。

2.2 eIF4H蛋白低表達(dá)抑制MEL細(xì)胞的增殖

與對(duì)照組和scramble-shRNA細(xì)胞相比，eIF4H-shRNA-2細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制。對(duì)照組、scramble-shRNA和eIF4H-shRNA-1細(xì)胞在3 d時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到平臺(tái)期，在4 d時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，而eIF4H-shRNA-2在4 d時(shí)才達(dá)到平臺(tái)期(圖2)。

2.3 eIF4H低表達(dá)阻礙了MEL細(xì)胞的周期進(jìn)程

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，eIF4H低表達(dá)后MEL細(xì)胞的周期G1期增加，S期減少，表明eIF4H低表達(dá)阻礙MEL細(xì)胞周期在G1期(圖3)。

2.4 eIF4H低表達(dá)促進(jìn)丁酸鈉誘導(dǎo)MEL細(xì)胞紅系分化

不加誘導(dǎo)劑丁酸鈉時(shí)，兩組細(xì)胞均檢測(cè)不到聯(lián)苯胺陽(yáng)性細(xì)胞。當(dāng)加入誘導(dǎo)劑丁酸鈉處理后，eIF4H-shRNA-2組聯(lián)苯胺陽(yáng)性細(xì)胞明顯高于scramble-shRNA組(p＜0.01)(圖4)。

3 討論

蛋白質(zhì)合成最主要的調(diào)控發(fā)生在翻譯起始階段，該過(guò)程需要多種eIF的調(diào)控。已發(fā)現(xiàn)一些eIF在腫瘤組織中是高表達(dá)的，eIF4E在多種癌細(xì)胞中高表達(dá)，過(guò)表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖和成瘤［5］。eIF4G在肺癌中高表達(dá)［6］。RNA解旋酶eIF4A在黑色素瘤和肝癌中高表達(dá)［7－8］。eIF4H在結(jié)腸癌中高表達(dá)，其表達(dá)下調(diào)后抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞系的增殖同時(shí)可誘導(dǎo)凋亡，這種抑制和誘導(dǎo)作用可通過(guò)cyclin D1的過(guò)表達(dá)來(lái)消除［9］。

eIF4H是一個(gè)重要的真核生物翻譯起始因子，能夠在蛋白質(zhì)翻譯的起始階段促進(jìn)核糖體向起始密碼子掃描，從而加速蛋白質(zhì)的合成。降低蛋白質(zhì)的合成被認(rèn)為與細(xì)胞增殖和分化有關(guān)。本研究通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)成功下調(diào)了MEL細(xì)胞中eIF4H兩個(gè)亞型的表達(dá)，為進(jìn)一步探究eIF4H低表達(dá)對(duì)MEL細(xì)胞增殖和紅系分化的影響提供了一個(gè)合適的細(xì)胞模型。MTT比色法和流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，eIF4H低表達(dá)后MEL細(xì)胞增殖能力明顯受到抑制，同時(shí)細(xì)胞周期阻滯在G1期，這意味著eIF4H低表達(dá)介導(dǎo)了MEL細(xì)胞的惡性逆轉(zhuǎn)。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)分析eIF4H低表達(dá)對(duì)MEL細(xì)胞周期的影響Fig 3 Flow cytometry analyzed the effect of eIF4H down-expression on the cell cycle of MEL cells

圖4 聯(lián)苯胺染色檢測(cè)eIF4H低表達(dá)對(duì)丁酸鈉誘導(dǎo)MEL細(xì)胞紅系分化的影響Fig 4 Benzidine staining analyzed erythroid differentiation of MEL cells affect by eIF4H down-expressed

eIF4H低表達(dá)抑制了MEL細(xì)胞增殖的同時(shí)，是否會(huì)調(diào)控紅系分化?本研究聯(lián)苯胺染色結(jié)果顯示，eIF4H低表達(dá)并不能誘導(dǎo)MEL細(xì)胞紅系分化，但可促進(jìn)丁酸鈉誘導(dǎo)MEL紅系分化。這可能是由于對(duì)紅系分化的調(diào)控往往表現(xiàn)在表達(dá)量的變化和細(xì)胞定位的遷移兩個(gè)層面，單一因素的改變并不能誘導(dǎo)MEL細(xì)胞紅系分化。

總之，本研究明確了eIF4H低表達(dá)可抑制MEL細(xì)胞增殖，并可促進(jìn)丁酸鈉誘導(dǎo)MEL細(xì)胞紅系分化，將為闡明白血病的發(fā)生和治療提供新的理論依據(jù)。

［1］Pal S，Cantor AB，Johnson KD，et al．Coregulator-dependent facilitation of chromatin occupancy by GATA-1［J］．Proc Nati Acad Sci U SA，2004，101:980－985．

［2］Rao G，Rekhtman N，Cheng G，et al．Deregulated expression of the PU．1 transcription factor blocks murine erythroleukemia cell terminal differentiation［J］．Oncogene，1997，14:123－131．

［3］Jayapal SR，Lee KL，Ji P，et al．Down-regulation of Myc is essential for terminal erythroid maturation［J］．J Biol Chem，2010，285:40252－40265．

［4］Richter-Cook NJ，Dever TE，Hensold JO，et al．Purification and characterization of a new eukaryotic protein translation factor．Eukaryotic initiation factor 4H［J］．J Biol Chem，1998，273:7579－7587．

［5］Ruggero D，Montanaro L，Ma L，et al．The translation factor eIF-4E promotes tumor formation and cooperates with c-Myc in lymphomagenesis［J］．Nat Med，2004，10:484－486．

［6］Bauer C，Diesinger I，Brass N，et al．Translation initiation factor eIF-4G is immunogenic，overexpressed，and amplified in patients with squamous cell lung carcinoma［J］．Cancer，2001，92:822 －829．

［7］Eberle J，Krasagakis K，Orfanos CE．Translation initiation factor eIF-4A1 mRNA is consistently overexpressed in human melanoma cells in vitro［J］．Int J Cancer，1997，71:396－401．

［8］Shuda M，Kondoh N，Tanaka K，et al．Enhanced expression of translation factor mRNAs in hepatocellular carcinoma［J］．Anticancer Res，2000，20:2489 －2494．

［9］Tomonaga T，Matsushita K，Yamaguchi S，et al．Identification of altered protein expression and post-translational modifications in primary colorectal cancer by using agarose two-dimensional gel electrophoresis［J］．Clin Cancer Res，2004，10:2007－2014．