王小玲，高 柱，劉騰云，譚胤靜，余發(fā)新*

(1.江西省科學(xué)院 生物資源研究所/江西省重金屬污染生態(tài)修復(fù)工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330096;2.江西省鄱陽湖重點實驗室，江西 南昌 330096)

觀賞羽扇豆因其特殊的花語、特別的植株形態(tài)、豐富的花序顏色和較高的經(jīng)濟用途而被廣泛利用。觀賞羽扇豆為自花授粉植物，通過近年的研究發(fā)現(xiàn)，在各省引種栽培后，種子結(jié)實率低，飽滿度不夠，主要以進口為主，成本較高［1］。植物組織培養(yǎng)法繁殖的突出特點是快速，且具有幾乎不受地理環(huán)境和季節(jié)限制、遺傳背景一致、生長周期短、成本低等諸多優(yōu)點，因此對觀賞羽扇豆這種“名、優(yōu)、特、新、奇”品種的繁殖意義重大。然而，污染、褐化和玻璃化被認(rèn)為是花卉組織培養(yǎng)技術(shù)環(huán)節(jié)中存在的三大殺手，會給科研和生產(chǎn)實踐帶來巨大危害。因此采取有效的防控措施，降低污染率發(fā)生的幾率，有效控制褐化和玻璃化現(xiàn)象，是實現(xiàn)花卉組織培養(yǎng)工廠化生產(chǎn)的重要保障。

目前，對于觀賞羽扇豆組織培養(yǎng)的研究還主要集中在生長激素對不定芽誘導(dǎo)、增殖和生根的影響方面［2-3］，對于如何減少污染及控制褐化和玻璃化現(xiàn)象的研究鮮有報道。本研究通過正交試驗方法，研究不同因素水平對觀賞羽扇豆組織培養(yǎng)過程中的污染、褐化和玻璃化現(xiàn)象的影響，建立高效的觀賞羽扇豆組織培養(yǎng)種苗生產(chǎn)體系，為其進一步的生理學(xué)、病理學(xué)、遺傳學(xué)、育種學(xué)以及生物化學(xué)等領(lǐng)域的研究提供技術(shù)手段，提高觀賞羽扇豆工廠化育苗方面產(chǎn)生的巨大經(jīng)濟和社會效益。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用的觀賞羽扇豆種子購自浙江虹越花卉有限公司，試管苗材料由江西省科學(xué)院生物資源研究所培育。

1.2 試驗方法

1.2.1 污染防止處理 將觀賞羽扇豆種子在4℃低溫下預(yù)處理15 d 后，選取均勻、飽滿種子，自來水室溫條件下浸泡4～6 h，使其吸水膨脹后，用流水沖洗30 min。預(yù)處理種子分別使用0.1%高錳酸鉀、70%乙醇和0.1%升汞，按照L9(34)正交表進行3 因素3 水平試驗處理，因素水平見表1。處理好的種子接種到MS+6 g/L 瓊脂+45 g/L 白糖培養(yǎng)基上，每組處理3 個重復(fù)，每個重復(fù)接種30 粒種子，培養(yǎng)25 d 后，統(tǒng)計污染率。

表1 污染防止L9(34)正交因素水平Tab.1 L9(34)orthogonal factors and levels of pollution control

1.2.2 褐化控制處理 預(yù)處理的觀賞羽扇豆種子按照1.2.1 方法選取的適宜組合消毒后，分別接種到添加吸附劑(活性炭、聚乙烯吡咯烷酮)和抗氧化劑(維生素C、檸檬酸)的MS+0.5 g/L 6-BA+6 g/L瓊脂+45 g/L 白糖培養(yǎng)基上，吸附劑和抗氧化劑的處理濃度見表2。每處理3 個重復(fù)，每個重復(fù)接種30粒種子，培養(yǎng)25 d 后，統(tǒng)計褐化率。

1.2.3 玻璃化控制處理 隨機選取觀賞羽扇豆第一次繼代培養(yǎng)后的正常苗和玻璃化苗，利用干重法測定組織含水量，丙酮法［4］測定葉綠素含量，蒽酮比色法［5］測定可溶性糖和淀粉含量。

將選取的觀賞羽扇豆第一次繼代培養(yǎng)后的正常苗，接種到按照L16(45)正交表進行的4 因素3 水平試驗處理組合中，因素水平見表3?；九囵B(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.8 mg/L GA3+2 g/L AC。每組處理3 個重復(fù)，每個重復(fù)接種30 個正常苗，培養(yǎng)30 d 后，統(tǒng)計玻璃化率。

表2 吸附劑與抗氧化劑處理Tab.2 Treatments of absorbents and antioxidants to control browning

表3 玻璃化控制L16(45)正交因素水平Tab.3 L16(45)orthogonal factors and levels of hyperhydric control

2 結(jié)果與分析

2.1 觀賞羽扇豆組織培養(yǎng)污染防止研究

通過調(diào)查分析，可用于組織培養(yǎng)外植體消毒的方法很多［6］，如升汞、雙氧水、次氯酸鈉、高錳酸鉀、碘化鉀、乙醇等等。經(jīng)全面考慮以及在以往試驗的基礎(chǔ)上［3］，本研究最后確定0.1%高錳酸鉀、70%乙醇和0.1%升汞為試驗因素，進行3 因素3 水平正交試驗，結(jié)果見表4。一方面，根據(jù)正交試驗的特性和試驗指標(biāo)污染率，KA2＜KA3＜KA1、KB2＜KB3＜KB1、KC3＜KC2＜KC1，可斷定A2、B2和C3分別為A、B、C 三因素的優(yōu)水平。三個因素的優(yōu)水平組合A2B2C3為本試驗的最優(yōu)水平組合，即觀賞羽扇豆組織培養(yǎng)消毒的最優(yōu)方法為0.1%高錳酸鉀30 min，70%乙醇40 s，0.1%升汞9 min。另一方面，根據(jù)極差Rj的大小，可以判斷各因素對試驗指標(biāo)的影響主次。比較本試驗各R 值的大小，可見RC＞RA＞RB，所以三因素對污染率影響的主→次順序是C→A→B，即0.1%升汞影響最大，其次是0.1%高錳酸鉀，70%乙醇影響較小。其原因可能是0.1%高錳酸鉀可有效清洗掉觀賞羽扇豆種子表面的菌類物質(zhì)，而升汞則可徹底殺死種子胚乳表面殘留的菌類物質(zhì)，所以兩者配合可有效降低污染率。

2.2 觀賞羽扇豆組織培養(yǎng)褐化控制研究

處理好的觀賞羽扇豆種子接種到添加不同濃度的吸附劑(表5)和抗氧化劑(表6)的培養(yǎng)基中，結(jié)果顯示，培養(yǎng)25 d 后，添加活性炭、PVP、維生素C 和檸檬酸的外植體平均褐化率分別是8.3%、13.0%、15.0%和10.8%，均顯著低于CK，其中吸附劑活性炭效果最好，抗氧化劑檸檬酸次之。添加1.0 g/L 活性炭時，平均褐化率比CK 顯著降低了6.4%，褐化程度較輕;添加2.0 g/L 活性炭時，平均褐化率最低，比CK 顯著降低了12.3%，褐化程度最輕;當(dāng)活性炭濃度增加到3.0 g/L，平均褐化率反而顯著提高(比CK 降低了9.2%)。由此表明，活性炭可顯著降低觀賞羽扇豆種子褐化率，但當(dāng)活性炭增加到一定濃度時，高濃度的活性炭在吸附培養(yǎng)基中有害物質(zhì)的同時，也吸附了培養(yǎng)基中的無機鹽、激素等營養(yǎng)成分［7］，致使培養(yǎng)基中的有效成分發(fā)生改變，不利于外植體誘導(dǎo)，褐化程度相對加重，因此必須選擇合適的活性炭濃度。

表4 污染防止L9(34)正交試驗方案及結(jié)果Tab.4 L9(34)orthogonal experimental program and result of pollution control

表5 吸附劑對褐化的影響及結(jié)果Tab.5 Effect and result of absorbents on browning control

表6 可知，觀賞羽扇豆褐化率同時受抗氧化劑種類和抗氧化劑濃度的影響，其中檸檬酸對觀賞羽扇豆褐化抑制效果較維生素C 顯著，且濃度越高，褐化率就越低，褐化程度越輕。試驗觀察結(jié)果還表明，隨著檸檬酸濃度的升高，觀賞羽扇豆誘導(dǎo)苗生長狀況緩慢。這可能是檸檬酸促使外植體氧化酶活性降低，同時抑制總酚的生成和擴散，有效控制培養(yǎng)基褐變的產(chǎn)生，但當(dāng)檸檬酸濃度過高時，植物細(xì)胞滲透勢增大，造成膜破壞，影響生長［8］。綜合考慮檸檬酸對觀賞羽扇豆褐化抑制和生長的影響，還有待于進一步研究檸檬酸的適宜濃度，或者研究吸附劑和抗氧化劑聯(lián)合使用效果。

表6 抗氧化劑對褐化的影響及結(jié)果Tab.6 Effect and result of antioxidants on browning control

選取吸附劑(活性炭2.0 g/L)和抗氧化劑(檸檬酸5.0 g/L)2 個處理和CK，進行觀賞羽扇豆褐變變化趨勢分析。結(jié)果顯示(圖1)，3 個處理的褐化率增長趨勢為CK＞檸檬酸＞活性炭;且均在25 d 以內(nèi)培養(yǎng)時，褐化率增幅較小;培養(yǎng)超過25 d 后，褐化率增幅明顯增大。其中CK 在培養(yǎng)第5 天最早發(fā)現(xiàn)褐變，檸檬酸在培養(yǎng)第10 天發(fā)現(xiàn)褐變，活性炭在培養(yǎng)第15 天最晚發(fā)現(xiàn)褐變。隨著培養(yǎng)時間的推移，褐變越嚴(yán)重，不同處理之間褐化率差異逐漸縮小。因此，觀賞羽扇豆外植體培養(yǎng)的周期應(yīng)控制在25 d 之內(nèi)。

2.3 觀賞羽扇豆組織培養(yǎng)玻璃化控制研究

觀賞羽扇豆試管苗在相同培養(yǎng)條件下，第1 次繼代培養(yǎng)25 d 后，取苗高相對一致的正常苗和玻璃化苗，測定其生理生化的變化結(jié)果(表7)顯示，玻璃化苗和正常苗生理生化指標(biāo)存在顯著差異。其中，玻璃化苗組織含水量、葉綠素a/b 比值和可溶性糖含量分別比正常苗顯著高出3.2%，0.63，3.39 mg/L;與其相反，玻璃化苗葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量、淀粉含量和干物質(zhì)積累卻分別比正常苗顯著降低了0.48，0.18，0.62，2.46 mg/L 和21%。說明玻璃化苗干物質(zhì)積累降低，葉綠素含量減少，光合能力減弱，導(dǎo)致光合直接產(chǎn)物可溶性糖轉(zhuǎn)化力和光合積累產(chǎn)物淀粉合成能力下降。

圖1 培養(yǎng)天數(shù)對3 種處理褐化率的影響Fig.1 Effect of culture days on browning rate of three treatments

表7 正常苗與玻璃化苗生理生化指標(biāo)對比結(jié)果Tab.7 Physiological and biochemical results of normal and hyperhydric shoots

表8 研究了不同水平組合的蔗糖、瓊脂、培養(yǎng)溫度和光照時間對觀賞羽扇豆第1 次繼代后的試管苗產(chǎn)生玻璃化現(xiàn)象的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn):培養(yǎng)條件一致情況下，蔗糖2(30 g/L)、瓊脂3(6 g/L)、培養(yǎng)溫度2(20 ℃)和光照時間3(14 h)組合時，試管苗玻璃化率最低為3.1%。對玻璃化率影響最大的因素是培養(yǎng)溫度，其次是蔗糖和瓊脂濃度，光照時間的影響最小。

表8 玻璃化控制L16(45)正交試驗方案及結(jié)果Tab.8 L16(45)orthogonal experimental program and result of hyperhydric control

3 結(jié)論與討論

外植體消毒是花卉組織培養(yǎng)體系建立過程中的首要基礎(chǔ)工作，也是最關(guān)鍵的步驟，消毒方法選擇不合理，將會引起嚴(yán)重的污染問題。大量研究表明，不同植物適宜的消毒方法差異很大。鄭穎等［9］采用0.1%升汞消毒臺灣榿木外植體9 min，并在培養(yǎng)基中添加50 mg/L 利福平、20 mg/L 鹽酸四環(huán)素或40 mg/L鹽酸四環(huán)素可將污染率控制在7.2%～15.6%。而大葉藻種子最好的消毒方法則是，分別用75%乙醇和1.5% KI 處理10 min，且不影響后續(xù)種子的萌發(fā)［6］。本研究中選取了3 種常用的種子消毒劑，進行了不同處理時間組合對觀賞羽扇豆種子消毒效果影響的研究。結(jié)果顯示，用0.1%高錳酸鉀浸泡30 min，再用70%乙醇處理40 s，最后用0.1%升汞處理9 min 是觀賞羽扇豆種子消毒的較好方法。而對于在培養(yǎng)中添加抗生素能否抑制觀賞羽扇豆組織培養(yǎng)過程中菌污染的影響，還有待于進一步開展研究。

在培養(yǎng)基中，加入抗壞血酸、檸檬酸、硫代硫酸鈉、半胱氨酸、聚乙烯吡咯烷酮等抗氧化劑，利用這些物質(zhì)的還原性，可有效抑制酚類物質(zhì)的氧化，從而降低褐化的發(fā)生。附加抗壞血酸0.125 g/L、亞硫酸鈉0.125 g/L 和檸檬酸2.5 g/L 的MS 培養(yǎng)基，可明顯抑制3 個大花蕙蘭品種產(chǎn)生褐變［10］。闕生全［11］在各種配比的培養(yǎng)基中，以添加吸附劑(活性炭和PVP)的培養(yǎng)基控制茶樹的褐變效果最好;添加抗氧化劑的培養(yǎng)基褐化較嚴(yán)重，其中添加硫代硫酸鈉培養(yǎng)的外植體褐化最嚴(yán)重。本研究結(jié)果則證明，單獨添加吸附劑和抗氧化劑均能抑制觀賞羽扇豆褐變的發(fā)生，其中吸附劑活性炭2.0 g/L 的抑制效果最好，抗氧化劑檸檬酸5.0 g/L 的抑制效果次之。然而，除吸附劑和抗氧化劑的種類外，還和其濃度有關(guān)，也有待進一步探索復(fù)合吸附劑或復(fù)合抗氧化劑比例是否對抑制褐化效果更好。

玻璃化是植物組織培養(yǎng)中試管苗的一種生理失調(diào)癥狀，嚴(yán)重影響組培快繁體系的穩(wěn)定性，造成人力、財力、物力的極大浪費。植物種類不同，引起試管苗被玻璃化的主導(dǎo)因素也存在一定差異。防風(fēng)［12］組織培養(yǎng)過程中，增加培養(yǎng)基內(nèi)瓊脂和蔗糖濃度，可以降低玻璃化率;當(dāng)6-BA 濃度超過2.0 mg/L、光照低于2 000 lx、培養(yǎng)瓶內(nèi)濕度較大時，玻璃化率明顯提高。培養(yǎng)基的種類和激素的使用濃度是引起花楸組織培養(yǎng)玻璃化的2 個主要原因［13］。光照時數(shù)少于8 h，光照強度低于1 000 lx 時，容易引起洋桔梗玻璃化［14］。為了防止觀賞羽扇豆組培中玻璃化現(xiàn)象，我們采取了調(diào)整蔗糖濃度、瓊脂濃度、培養(yǎng)溫度和光照時間等措施，結(jié)果表明，選取蔗糖濃度30 g/L、瓊脂濃度6 g/L、培養(yǎng)溫度20 ℃和光照時間14 h，可明顯抑制玻璃化現(xiàn)象。也有研究表明，在培養(yǎng)基中附加活性炭［15］、赤霉素［16］、青霉素［17］、多效唑［18］等措施均可有效減輕或防治玻璃化。本試驗沒有進行添加附加物這方面的探討，今后將逐步進行深入研究。

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