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3種弱有機(jī)酸結(jié)合NaCl腌制對(duì)牛肉結(jié)締組織濾渣膠原蛋白特性的影響*

2014-12-16 08:04常海軍周文斌朱建飛唐春紅
食品與發(fā)酵工業(yè) 2014年6期
關(guān)鍵詞:濾渣有機(jī)酸膠原蛋白

常海軍,周文斌,朱建飛,唐春紅

(重慶工商大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院,重慶高校催化理論與應(yīng)用技術(shù)市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶,400067)

肉的腌制處理,包括酸腌漬處理是肉常見的一種腌制嫩化方法[1]。肉的酸漬腌制過程可通過將肉浸泡在乳酸、醋酸和果汁酸等一些酸液中進(jìn)行[2]。研究認(rèn)為,酸腌制對(duì)肉的嫩化可能是由于肌原纖維的膨脹對(duì)肌肉結(jié)構(gòu)的弱化[3]以及酸漬過程對(duì)肌束膜等結(jié)締組織膠原蛋白的直接弱化所致[4]。

膠原蛋白是構(gòu)成肌內(nèi)結(jié)締組織的主要結(jié)構(gòu)蛋白,是一種具有一定韌性和剪切性的纖維狀蛋白[5]。肌肉的韌性在一定程度上與肌肉內(nèi)膠原蛋白的含量成正比,肌內(nèi)結(jié)締組織膠原蛋白被認(rèn)為是影響肉嫩度的第二種主要蛋白成分[6]。研究發(fā)現(xiàn),在肉制品加工過程中膠原蛋白熱力學(xué)特性變化對(duì)其品質(zhì)起到一定的影響作用[7]。結(jié)締組織濾渣膠原蛋白是肌肉結(jié)締組織的提取物,其主要成分為肌束膜和肌內(nèi)膜結(jié)締組織膠原蛋白[8]。研究表明,畜禽肌肉品質(zhì)在一定程度上受到結(jié)締組織濾渣膠原蛋白特性的影響,包括其含量、溶解性以及熱收縮溫度等[4-5]。

本研究以牛半腱肌肉為材料,乳酸、醋酸、檸檬酸和NaCl為腌制劑,探討不同腌制對(duì)牛肉結(jié)締組織濾渣膠原蛋白特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛半腱肌,選擇來自同一育肥場、品種和飼養(yǎng)管理相同的土種黃牛的改良后代(西門塔爾×南陽黃牛)公牛5頭,屠宰后牛半胴體在4℃冷庫中成熟48h后進(jìn)行取樣,從半胴體上取下整條半腱肌,所選胴體其大理石花紋、生理成熟度和背膘厚度等指標(biāo)基本相似,然后分割成2.5cm厚肉塊若干個(gè)。

Ⅰ型膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(牛跟腱),美國Sigma公司;標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品 Marker(次高分子質(zhì)量:43~200kDa),北京索萊寶科技有限公司(Solarbio);乳酸、醋酸、檸檬酸和NaCl,均為食品級(jí)(國產(chǎn))。其他所用化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MC-DSC差示掃描量熱儀,美國TA Instrument公司;AllegraTM64R Centrifuge臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),美國Beckman-Coulter公司;Alpha2-1.2冷凍干燥機(jī),德國Christ;Ultra-Turrax T25 BASIC高速勻漿器,德國Ika-Werke公司;直插式pH計(jì),英國Thermo Scientific公司;ZKSY-600智能恒溫水箱,南京科爾儀器設(shè)備有限公司;Shimadzu AUY120電子天平,日本島津公司;GBF-C-321型雪皇冷藏柜,杭州偉龍制冷設(shè)備有限公司;DY602S穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀,南京大學(xué);Universal HoodⅡ凝膠成像儀,美國BIO-RAD公司;TY-80B脫色搖床,南京大學(xué);78-1型磁力攪拌器,金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 腌制處理

將牛半腱肌肉(pH值在5.6~5.8)分割成2.5 cm×5.0 cm×5.0 cm大小的肉塊[約(100 ±5)g]若干,隨即分組并稱重,置于下列弱有機(jī)酸和NaCl的不同組合腌制劑中,于4℃條件下浸泡腌制24h,其中不經(jīng)腌制處理的作為對(duì)照組。腌制處理組分別為:(1)2%NaCl,(2)1.5%乳酸,(3)1.5%乳酸 +2%NaCl,(4)1.5% 醋酸,(5)1.5% 醋酸 +2%NaCl,(6)1.5%檸檬酸,(7)1.5%檸檬酸 +2%NaCl。每組腌制共6小塊肉樣,肉樣與腌制液之比為1∶5(g∶mL)。腌制完成后,用吸水紙吸干肉塊表面水分,稱重后進(jìn)行真空包裝,于4℃貯藏待分析。

1.3.2 結(jié)締組織濾渣膠原蛋白提取

腌制處理前后肉樣結(jié)締組織濾渣膠原蛋白的提取參照 Li等[8]和 Chang 等[9]方法,并作了部分修改。具體方法如下:取50 g肉樣(濕重),切成約為1 cm3的肉丁,加入50 mL預(yù)冷的CaCl2(50 mmol/L),用高速勻漿器在3 000 r/min絞碎30 s,經(jīng)尼龍網(wǎng)(100目)過濾,濾渣用40 mL預(yù)冷的50 mmol/L CaCl23 000 r/min絞碎20 s,再過濾,上述過程再重復(fù)2次。最終得到的濾渣稱為結(jié)締組織濾渣膠原蛋白。最后經(jīng)真空冷凍干燥后稱重,其含量以占樣品濕重的百分比計(jì)算。

1.3.3 結(jié)締組織濾渣膠原蛋白SDS-PAGE電泳

精確稱取0.5 g膠原蛋白樣品,加入35 mL 0.5 mol/L的醋酸溶液于4℃振蕩溶解48 h。采用不連續(xù)SDS-PAGE電泳系統(tǒng),參照陸應(yīng)林等[10]和汪家政等[11]文獻(xiàn),部分操作條件進(jìn)行了改進(jìn)。分離膠濃度為7.5%,濃縮膠濃度為5%。將結(jié)締組織濾渣膠原蛋白溶液(稀釋到濃度約為1 mg/mL)與樣品緩沖液(60 mmol/L Tris-HCl,25% 甘油,2%SDS,14.4 mmol/L2-琉基乙醇,0.1%溴酚蘭,pH 6.8)以體積比 4∶1混勻,在沸水中水浴3~5 min,離心2~3 min,取出冷卻,上樣量為30 μL,次高分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker上樣量為5 μL。在電壓為80 V下恒壓電泳3h。電泳結(jié)束之后,用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液(0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250,5%甲醇,45%乙酸)染色1 h,在搖床上用考馬斯亮藍(lán)脫色液(10%甲醇,10%乙酸)脫色直至背景清晰。用生物電泳圖像分析系統(tǒng)照相,分析。

1.3.4 結(jié)締組織濾渣膠原蛋白DSC分析

經(jīng)分離提取后的結(jié)締組織濾渣膠原蛋白用差示掃描量熱儀(DSC)分析其熱量變化(用量5.0 mg),溫度掃描為20~100℃,升溫速率2℃/min,用TA instrument自帶分析軟件(universal analysis 2000)對(duì)熱流變化曲線進(jìn)行分析,計(jì)算樣品熱變性溫度。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

運(yùn)用SPSS16.0一般線性模型(GLM)對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差(ANOVA)分析、LSD多重比較以及相關(guān)性分析。各實(shí)驗(yàn)指標(biāo)值測定重復(fù)3次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛肉腌制處理過程中結(jié)締組織濾渣膠原蛋白含量的變化

由圖1可見,除乳酸腌制之外,其他腌制處理組牛肉結(jié)締組織濾渣膠原蛋白含量與對(duì)照組相比均升高,且乳酸腌制組與對(duì)照組之間無顯著差異(P>0.05)。另外,各弱有機(jī)酸與NaCl結(jié)合腌制處理組牛肉結(jié)締組織濾渣膠原蛋白含量較有機(jī)酸單獨(dú)腌制處理極顯著增高(P<0.01)。結(jié)締組織濾渣主要成分為肌束膜和肌內(nèi)膜,以及含有部分的肌纖維成分,牛肉中肌束膜成分占膠原蛋白總量的90%以上[12],是構(gòu)成結(jié)締組織的主要成分,也是決定肉“背景嫩度”的關(guān)鍵成分[6],本研究結(jié)果顯示,不同腌制劑的結(jié)合處理在一定程度上增加了結(jié)締組織濾渣膠原蛋白含量,其原因可能與不同腌液的pH值以及離子強(qiáng)度引起的肌束膜和肌內(nèi)膜膠原蛋白發(fā)生變性以及凝膠化轉(zhuǎn)化程度有關(guān),另外,酸與NaCl結(jié)合處理時(shí),腌制液pH值較酸單獨(dú)處理時(shí)更低,腌制液整個(gè)系統(tǒng)具有較低的pH值和較高的離子強(qiáng)度,可能對(duì)溶解結(jié)締組織膠原蛋白以及基質(zhì)多糖起作用的β-半乳糖苷酶和β-葡糖醛酸酶的釋放和活性受到抑制,因而可提取的結(jié)締組織濾渣膠原蛋白含量有所增加。

圖1 三種弱有機(jī)酸和NaCl結(jié)合腌制過程中牛肉結(jié)締組織濾渣膠原蛋白含量的變化Fig.1 Changes in contents of connective tissue filtering residue collagen from beef muscle following marination treatment

2.2 腌制處理過程中牛肉結(jié)締組織濾渣膠原蛋白SDS-PAGE電泳

3種弱有機(jī)酸和NaCl結(jié)合腌制過程中牛肉結(jié)締組織濾渣膠原蛋白SDS-PAGE電泳如圖2所示。

圖2 腌制后牛肉結(jié)締組織濾渣膠原蛋白SDS-PAGE電泳圖譜Fig.2 SDS-PAGE of connective tissue filtering residue collagen from beef muscle following marination treatment

由圖2可知,結(jié)合Ⅰ型膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照組(未經(jīng)腌制處理組),牛肉經(jīng)不同腌制處理對(duì)結(jié)締組織濾渣膠原蛋白不同分子量蛋白濃度的影響不顯著,尤其對(duì)40 kDa附近的低分子質(zhì)量蛋白無顯著降解作用。而前期研究發(fā)現(xiàn),弱有機(jī)酸與NaCl結(jié)合腌制對(duì)牛肉全肌肉蛋白的降解變化較為顯著[13],由此可見,這種變化主要源于肌纖維蛋白成分的變化所致。

2.3 腌制處理過程中牛肉結(jié)締組織濾渣膠原蛋白熱力特性的變化

弱有機(jī)酸結(jié)合NaCl不同腌制劑處理過程中牛肉結(jié)締組織濾渣膠原蛋白熱力特性的變化見圖3。

圖3 經(jīng)腌制處理后牛肉結(jié)締組織濾渣膠原蛋白熱力特性的變化Fig.3 Changes in thermal shrinkage temperatures of connective tissue filtering residue collagen of beef muscle following marination treatment

由圖3可見,經(jīng)腌制處理后牛肉結(jié)締組織濾渣膠原蛋白Te溫度較對(duì)照組相比變化不大,To和Tp溫度有較大變化。各弱有機(jī)酸與NaCl結(jié)合腌制處理組牛肉結(jié)締組織濾渣膠原蛋白變性峰溫度(Tp溫度)較有機(jī)酸單獨(dú)腌制處理增高,可見,弱有機(jī)酸與NaCl結(jié)合腌制處理增強(qiáng)了牛肉結(jié)締組織濾渣膠原蛋白的熱穩(wěn)定性。

To為結(jié)締組織膠原蛋白熱變性起始溫度,反映膠原蛋白的最低熱穩(wěn)定性,Tp為最大熱變性溫度,反映膠原蛋白的一般熱穩(wěn)定性,通常用最大熱變性溫度來反映膠原蛋白的熱穩(wěn)定特性[4,14]。Bailey 等[15]報(bào)道哺乳動(dòng)物膠原蛋白的最大熱變性溫度為65℃左右,但對(duì)不同的動(dòng)物屬種和肌肉類型有也差別。

本研究中,牛肉結(jié)締組織濾渣膠原蛋白雖經(jīng)純化分離,但由于腌制處理過程中,由于不同腌制液pH值以及離子強(qiáng)度的影響,部分處理組肌原纖維和膠原纖維發(fā)生變性,導(dǎo)致分離純化過程中可能還含有極少量的肌原纖維成分,另外,肌束膜和肌內(nèi)膜耐受腌制處理影響程度表現(xiàn)不一致,即受破壞程度不同,二者共同決定了肌肉結(jié)締組織濾渣膠原蛋白的熱力特性。

2.4 相關(guān)性分析

在牛肉腌制處理過程中,對(duì)牛肉結(jié)締組織濾渣膠原蛋白含量以及熱力特性之間的相關(guān)性分析見表1。

表1 經(jīng)腌制處理后牛肉結(jié)締組織濾渣膠原蛋白特性變化相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis among the characteristic changes of beef connective tissue filtering residue collagen following marination treatment(n=24)

由表1相關(guān)性分析可知,牛肉結(jié)締組織濾渣膠原蛋白含量與其熱穩(wěn)定性之間相關(guān)性不顯著,而結(jié)締組織濾渣膠原蛋白最大變性溫度(Tp峰溫度)與最終變性溫度(Te溫度)之間呈極顯著相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.844。

3 結(jié)論

牛肉經(jīng)3種弱有機(jī)酸(乳酸、醋酸和檸檬酸)以及和NaCl的結(jié)合腌制處理使得結(jié)締組織濾渣膠原蛋白含量和熱力特性發(fā)生了一定程度的變化。與對(duì)照組相比,NaCl以及3種不同腌制劑的結(jié)合處理在一定程度上增加了結(jié)締組織濾渣膠原蛋白含量。牛肉經(jīng)不同腌制處理對(duì)結(jié)締組織濾渣膠原蛋白不同分子質(zhì)量蛋白濃度的影響不顯著。3種弱有機(jī)酸與NaCl結(jié)合腌制處理增加了牛肉結(jié)締組織濾渣膠原蛋白熱變性峰溫度,表明其熱穩(wěn)定性更加趨于穩(wěn)定。

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