烏仁圖雅，德亮亮，扎木蘇，秦艷婷，陳紅霞，劉文俊，張和平，孟和畢力格

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重要實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特，010018)

保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌是乳酸菌中最具有應(yīng)用價值的菌種，尤其是在酸奶發(fā)酵中，常常作為發(fā)酵劑菌種。保加利亞乳桿菌在酸奶生產(chǎn)過程中的作用非常重要，是酸奶產(chǎn)品產(chǎn)黏、產(chǎn)香、產(chǎn)酸的主要菌種之一［1］。在酸奶發(fā)酵過程中通常采用德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus)和嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)作為發(fā)酵劑菌種［2］。發(fā)酵劑發(fā)酵特性即產(chǎn)酸、產(chǎn)香、產(chǎn)黏、蛋白和脂肪分解、乳糖代謝和后酸化等直接關(guān)系到發(fā)酵乳制品的品質(zhì)和特性。

保加利亞乳桿菌發(fā)酵特性主要包括:(1)產(chǎn)香特性。保加利亞乳桿菌在發(fā)酵過程中能夠產(chǎn)生特殊的香氣，主要是乳酸和羰基類化合物組成，例如:乙醛、丙酮、雙乙酰，其中乙醛是主要的風(fēng)味物質(zhì)，乙醛含量的多少決定了發(fā)酵乳的風(fēng)味［3-4］。保加利亞乳桿菌是酸奶生產(chǎn)過程中主要產(chǎn)乙醛的菌株，是由于保加利亞乳桿菌中的蘇氨酸醛縮酶活性要比嗜熱鏈球蘇氨酸醛縮酶活性菌強［5-6］;(2)產(chǎn)酸特性。保加利亞乳桿菌具有非常強的產(chǎn)酸能力和耐酸性，是酸奶發(fā)生后酸化的主要發(fā)酵劑菌株，在貯藏期間使酸奶的pH值持續(xù)下降，以致出現(xiàn)消費者不可接受的高酸度及感官質(zhì)量下降的現(xiàn)象［7-8］。

在自然狀況下篩選出風(fēng)味獨特、后酸化能力弱、活力較高的具有優(yōu)良發(fā)酵特性的保加利亞乳桿菌是制備高效發(fā)酵劑和生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)酸奶的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和首要任務(wù)。近年來，劉娜等人［9］通過保加利亞乳桿菌對牛乳的pH值、滴定酸度、黏度、游離氨基氮和脫水收縮性等指標產(chǎn)生的影響進行分析，篩選出了具有優(yōu)良發(fā)酵特性的保加利亞乳桿菌。高姝冉［10］也有類似報道。李延華等人［11］通過對發(fā)酵乳的風(fēng)味成分進行分析，篩選出了發(fā)酵特性優(yōu)良的保加利亞乳桿菌。另外，徐成勇等人［12］以保加利亞乳桿菌后酸化能力弱為依據(jù)，最終篩選出優(yōu)良菌株。而優(yōu)質(zhì)的發(fā)酵劑不僅后酸化能力弱，且需風(fēng)味獨特，因此，本實驗結(jié)合保加利亞乳桿菌的產(chǎn)酸特性和產(chǎn)香特性為依據(jù)篩選出具有優(yōu)良發(fā)酵特性的保加利亞乳桿菌，為開發(fā)直投式酸奶發(fā)酵劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

試驗所用的11株發(fā)酵乳桿菌(IMAU20234，IMAU20775，IMAU20342，IMAU20360，IMAU20706，IMAU20295，IMAU20423，IMAU20136，IMAU20227，IMAU20404，ND02)從牧區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離得到，現(xiàn)保藏于作者所在實驗室乳酸菌菌種資源庫;Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus ND02 為該實驗室以商業(yè)發(fā)酵劑公司Chr．Hansen的YC-X11中的德氏乳桿菌保加利亞亞種作為對照篩選出的具有優(yōu)良發(fā)酵特性的菌株［13］，因此本研究以ND02為對照菌株。

1.2 原料與試劑

全脂奶粉(新西蘭恒天然集團)，乙醛檢測試劑盒 K-ACHYD(Megazyme，Ireland)，MRS(Man Rogosa Sharpe)液體、固體合成培養(yǎng)基(CM0785B，英國OXOID公司)，雙乙酰標品、三氯乙酸 (國藥集團化學(xué)試劑有限公司)等。

2 實驗方法

2.1 菌株的活化培養(yǎng)

將11株供試菌株于MRS液體培養(yǎng)基活化，并連續(xù)傳2代，采用MRS固體培養(yǎng)基傾注法，進行保加利亞乳桿菌活菌計數(shù)。

2.2 發(fā)酵乳樣品的制備

全脂復(fù)原乳(全脂粉11．5%、蔗糖6．5%)預(yù)熱至60℃然后高壓均質(zhì)，95℃殺菌10 min，急冷之后按添加量5×106CFU/g接入發(fā)酵劑，置于42℃培養(yǎng)發(fā)酵至pH 4．5時終止發(fā)酵，置于4℃冰箱中后熟21 d。

2.3 保加利亞乳桿菌產(chǎn)酸特性試驗

2．3．1 菌株發(fā)酵時間的確定

發(fā)酵乳樣品從發(fā)酵開始到發(fā)酵乳pH值下降至4．5所需時間為發(fā)酵時間，在發(fā)酵期間，每隔4 h測定1次發(fā)酵乳樣品的pH值，當發(fā)酵乳pH值下降至4．5時終止發(fā)酵并確定其發(fā)酵時間。

2．3．2 貯藏期間發(fā)酵乳樣品pH值的測定

在后熟期間，分別在 0、8、12、24、36、48 h、7、14 d和21 d測定發(fā)酵乳pH值。取3個平行乳樣品，冷卻至17～20℃，采用pH計測量pH值。

2．3．3 貯藏期間滴定酸度的測定

后熟期間分別在 0、8、12、24、36、48 h、7、14 d 和21 d測定其滴定酸度。準確稱量5．00 g發(fā)酵乳樣品勻漿，至少取3個平行，置于100 mL三角瓶中，加入40 mL新煮沸冷卻至40℃(去CO2)水，再加入2滴0．5%的酚酞乙醇溶液作指示劑，輕輕搖勻，用0．1 mol/L的NaOH標準溶液滴定至微紅色在30 s內(nèi)不消失為止。公式如下:

2.4 保加利亞乳桿菌產(chǎn)香特性試驗

一般在發(fā)酵結(jié)束后48 h之內(nèi)保加利亞乳桿菌風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)量達到最高值，之后隨著貯藏時間的延長而下降。其中乙醛在4℃冷藏后含量有較大變化，一般在12 h和24 h達到最高［14］。因此本研究在發(fā)酵乳后熟期間，分別在 0、8、12、24、36、48 h、7、14 d 和21 d測定發(fā)酵乳樣品中風(fēng)味物質(zhì)乙醛和雙乙酰的含量。

2．4．1 乙醛含量的測定

在后熟期間，分別在 0、8、12、24、36、48 h、7、14d和21 d采集樣品。按照以下操作進行乙醛含量測定:分別取5．00 g乳樣加0．5 mL 20%的檸檬酸、再加10 mL三蒸水、搖勻、室溫放置10 min，然后在4℃，4 000 r/min離心10 min取上清，用濾菌器過濾收集于1．5 mL EP管中。采用乙醛檢測試劑盒 KACHYD，具體方法參照試劑盒說明書。

2．4．2 雙乙酰的檢測方法

(1)發(fā)酵乳樣品前處理:取發(fā)酵乳樣15 mL，加15 mL16%的三氯乙酸溶液，混勻、室溫靜置10 min，然后在4℃，4 000 r/min離心10 min，將上清液用濾紙過濾1遍，以保證澄清。同時，用無菌的全脂乳作為對照。

(2)雙乙酰的測定:用微量進樣器吸取20 μL雙乙酰標準品，溶于蒸餾水中并定容至500 mL。取12支編號的試管分成 2 排放置，分別加 0．0、2．0、4．0、6．0、8．0、10．0 mL 的標準溶液各 2 管，并分別用蒸餾水補足10 mL，每管中分別加10 mL 16%的三氯乙酸，這時雙乙酰標準溶液的濃度分別為 0．0、4．0、8．0、12．0、16．0 和 20．0 μg/mL。第 1 排試管中加入0．25 mL 1%的鄰苯二胺溶液，第2排試管不加作為對照組;搖勻后置于黑暗處放置30 min。反應(yīng)完成后加入 4．0 mol/L HCl終止反應(yīng)，第 1排試管加 1．0 mL，第2排試管加1．25 mL，混勻后以第2排試管空白作為參比液，在335 nm波長下用石英比色皿測定吸光度值。以雙乙酰濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。取待測樣品，用16%的三氯乙酸溶液稀釋適當?shù)谋稊?shù)，重復(fù)上述過程，然后根據(jù)雙乙酰標準曲線可獲得待測樣品中雙乙酰質(zhì)量濃度(μg/mL)。

3 實驗結(jié)果

3.1 發(fā)酵時間的確定

不同 Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus菌株從發(fā)酵開始至發(fā)酵終點(發(fā)酵乳pH 4．5時)所需要的時間如表1所示。

表1 不同Lb.delbrueckii ssp.bulgaricus菌株發(fā)酵乳發(fā)酵時間Table 1 Time required for yogurt fermentation with different Lb.delbrueckii ssp.bulgaricus strains

由表1可知，11株供試菌中3株(IMAU20136、IMAU20227、IMAU20404)發(fā)酵時間超過23 h，因此在后續(xù)試驗中篩除。其余7株菌的發(fā)酵時間基本集中在10～15 h，并且通過比較對照菌株ND02，其發(fā)酵用時為15．67 h，比8株菌都長。因此，根據(jù)菌株發(fā)酵所需的時間初步選定 IMAU20234、IMAU20775、IMAU20342、IMAU20360、IMAU20706、IMAU20295和IMAU20423可能會作為優(yōu)良菌株。

3.1 貯藏期間pH值變化

圖1是由不同 Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus發(fā)酵的發(fā)酵乳在發(fā)酵終點0 h以及4℃條件下后熟8 h、12 h、24 h、36 h、48 h、7 d、14 d 和21 d 的 pH 值變化。

圖1 不同Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus發(fā)酵乳樣品貯藏期間pH值的變化Fig．1 The pH values of fermented milk with different Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus strains during storage time

由圖1可知，貯藏0～48 h期間各菌株發(fā)酵乳的pH值變化趨緩，貯藏第7天時，菌株IMAU20706、IMAU20295和IMAU20423發(fā)酵乳pH值迅速下降。其中，IMAU20295發(fā)酵乳的pH值下降得最快，貯藏21 d時pH下降至3．65;這是由于后酸化能力強的保加利亞乳桿菌，發(fā)酵乳pH值3．8時仍能夠繼續(xù)生長，同時分解乳糖產(chǎn)生乳酸，導(dǎo)致發(fā)酵乳pH值持續(xù)下降，嚴重影響發(fā)酵乳質(zhì)量［15］。對照菌株ND02發(fā)酵乳的pH值下降相對慢，貯藏第21天時pH值仍為4．20。菌株 IMAU20234、IMAU20775、IMAU20432 和IMAU20360發(fā)酵乳的pH值降的相對較慢，貯藏第21天時，發(fā)酵乳的 pH 值分別為 4．11、4．17、4．10 和4．08，表明后酸化能力較弱。

3.2 貯藏過程中滴定酸度變化

不同 Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus發(fā)酵的發(fā)酵乳滴定酸度在發(fā)酵終點0 h以及4℃條件下后熟8 h、12 h、24 h、36 h、48 h、7 d、14 d 和21 d 如圖2 所示。

圖2 不同Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus發(fā)酵乳貯藏時間滴定酸度(TA)的變化Fig．2 The TA of fermented milk with different Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus strains during storage time

由圖2可知，貯藏過程中各菌株發(fā)酵乳的滴定酸度顯著升高(P＜0．05)。貯藏0～8 h內(nèi)滴定酸度上升較快，是由于菌株發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸較快。朱秋勁報道的發(fā)酵乳后熟12 h內(nèi)是乳酸菌產(chǎn)酸的主要階段［16］，與本研究的結(jié)論基本一致。貯藏前12～48 h內(nèi)，各菌株發(fā)酵乳的滴定酸度增長趨緩。貯藏第7天時，菌株IMAU20706、IMAU20295和 IMAU20423發(fā)酵乳的酸度顯著高于其他菌株，該3株菌貯藏到21 d時發(fā)酵乳的酸度分別為 102．13、105．88 和 95．11 °T。對照菌ND02發(fā)酵產(chǎn)品的酸度僅為70．28°T，因此該3株菌的耐酸性強，產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶活性好，能夠不斷產(chǎn)生乳酸，使發(fā)酵乳滴定酸度不斷升高，是后酸化能力較強的菌株。而菌株 IMAU20234、IMAU20775、IMAU20432和 IMAU20360貯藏到21 d時，發(fā)酵乳滴定酸度變化較小，表明這4株菌在貯藏期間的后酸化能力較弱。

3.3 發(fā)酵乳乙醛含量變化

乙醛是酸奶風(fēng)味物質(zhì)中最主要的成分，發(fā)酵乳中乙醛的含量是評價酸奶質(zhì)量的重要指標之一。目前，國內(nèi)生產(chǎn)的酸奶主要是以乙醛風(fēng)味為主的醛香型酸奶。Handan［17］指出高含量乙醛是形成發(fā)酵乳良好風(fēng)味的前提，在5～21 μg/g范圍內(nèi)乙醛含量越高對發(fā)酵乳的風(fēng)味越有利。Sandine等［18］報道過，在發(fā)酵乳中乙醛的濃度只有高于8 μg/g時，才能產(chǎn)生具有良好風(fēng)味的發(fā)酵乳。劉寧寧［19］等人研究報道發(fā)酵乳乙醛含量5 mg/L可品嘗到，質(zhì)量含量超過30 mg/L時，會使酸奶產(chǎn)生不愉快的風(fēng)味。本研究乙醛含量測定結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus發(fā)酵乳貯藏時間乙醛產(chǎn)量的變化Fig．3 The acetaldehyde content of Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus strains during storage time

從圖3可以看出，發(fā)酵乳乙醛含量24～36 h內(nèi)達到峰值，之后隨著貯藏時間的延長而下降。Beshkova報道，發(fā)酵乳乙醛含量后熟期間一直處于增長狀態(tài)，在22 h達到其峰值，而不同菌株，其含量達峰值時間有一定差別，大致在22～31 h［6］，本研究所得結(jié)論基本與此一致。菌株IMAU20706和IMAU20295分別在貯藏 24、36 h時達到峰值(含量為 41．53、48．61 μg/g)，貯藏期間第7天其乙醛含量仍在30 μg/g以上。這2株菌乙醛含量過高，對酸奶風(fēng)味不利，會使酸奶產(chǎn)生不愉快的風(fēng)味。對照菌ND02乙醛含量變化在4．39～9．69 μg/g之間。菌株IMAU20234、IMAU20775、IMAU20432 和 IMAU20360乙醛含量變化在5～15 μg/g之內(nèi)，認為是風(fēng)味較好的菌株，尤其菌株IMAU20775乙醛含量變化在9．00～13．47 μg/g之間，高于菌株IMAU20234、IMAU20432和IMAU20360。而菌株IMAU20423乙醛含量在整個過程中都低于4 μg/g，該菌被認為是極弱風(fēng)味菌種，不適合做發(fā)酵劑菌種。

3.4 發(fā)酵乳雙乙酰含量變化

不同 Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus發(fā)酵的發(fā)酵乳在發(fā)酵終點0 h以及4℃下后熟8 h、12 h、24 h、36 h、48 h、7 d、14 d和21 d的雙乙酰含量如圖4所示。

圖4 不同Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus發(fā)酵乳貯藏時間乙醛產(chǎn)量的變化Fig．4 The acetaldehyde content of Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus strains during storage time

從圖4可以看出，不同菌株發(fā)酵的發(fā)酵乳雙乙酰含量之間存在著差異，菌株雙乙酰含量隨貯藏時間的延長變化規(guī)律有所不同，菌株 IMAU20295、IMAU20423和ND02發(fā)酵乳雙乙酰含量發(fā)酵終點時達到峰值，隨著貯藏時間的延長下降，貯藏到21 d時又有 所 上 升。菌 株 IMAU20234、IMAU20775、IMAU20432、IMAU20360和 IMAU20706發(fā)酵乳雙乙酰含量隨著貯藏時間的延長上升達到峰值，然后開始下降，貯藏到第14天、21天時又有上升的趨勢，這與Marshall［20］報道，低pH有利于雙乙酰合成，本研究得出的結(jié)論與此一致。康歡［21］等也有類似報道，隨著pH的降低和酸度的增加，雙乙酰含量隨之增加。研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品中2 μg/mL的雙乙酰即可表現(xiàn)出特有的奶油香味［22］，與對照菌株ND02比較，將在貯藏期間產(chǎn)雙乙酰量高于2 μg/mL，且在后熟期間含量較穩(wěn)定的菌株為IMAU20775，是開發(fā)商業(yè)發(fā)酵劑的潛在菌株。

4 結(jié)論

通過對11株保加利亞乳桿菌菌株在發(fā)酵乳發(fā)酵過程以及4℃貯藏 0、8、12、24、36、48 h、7、14 d和21 d期間的pH值、滴定酸度，產(chǎn)乙醛和雙乙酰能力等一系列指標的測定及評價，同時記錄每種保加利亞乳桿菌的發(fā)酵時間并對測定的結(jié)果進行分析，篩選出1株發(fā)酵特性優(yōu)良的菌株IMAU20775，其發(fā)酵時間較短(12．38 h);后酸化能力較弱，4℃貯藏21d后滴定酸度的僅為70．56°T;產(chǎn)乙醛能力較好，發(fā)酵乳乙醛含量變化在9．00～13．47 μg/g;另外，發(fā)酵乳后熟期間產(chǎn)雙乙酰含量在 1．85～3．04 μg/mL 之間，且較穩(wěn)定。IMAU20775所具有的優(yōu)良發(fā)酵特性可作為研制開發(fā)優(yōu)良發(fā)酵乳及發(fā)酵飲料的發(fā)酵劑菌種。

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