劉排 蔣娟 張津萍 尢永燕 沙仲 孫厚華 龔匡隆 孫建方

生殖支原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥突變位點(diǎn)研究

劉排 蔣娟 張津萍 尢永燕 沙仲 孫厚華 龔匡隆 孫建方

目的了解生殖支原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥相關(guān)的23S rRNA基因突變情況。方法就診于我院性病門診的91例近期應(yīng)用過大環(huán)內(nèi)酯類藥物治療的持續(xù)性和復(fù)發(fā)性尿道炎患者,取尿道拭子和前段尿標(biāo)本進(jìn)行生殖支原體(Mg)、沙眼衣原體(Ct)、解脲脲原體(Uu)等病原體檢測(cè),篩選出單一生殖支原體陽(yáng)性患者標(biāo)本,應(yīng)用套式PCR擴(kuò)增與大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥性相關(guān)的23S rRNA基因V區(qū)片段,擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序,測(cè)得序列與美國(guó)國(guó)立生物信息中心已登記的生殖支原體標(biāo)準(zhǔn)株G37的相應(yīng)基因序列比對(duì)。結(jié)果91例的標(biāo)本中,Mg陽(yáng)性21例,Ct陽(yáng)性18例(19.8%),Uu陽(yáng)性10例,Mg與UU同時(shí)陽(yáng)性2例,Ct與Uu同時(shí)陽(yáng)性3例,Mg、Ct和Uu檢測(cè)均為陰性者37例。21例Mg陽(yáng)性標(biāo)本中,18例的標(biāo)本成功擴(kuò)增出23S rRNA基因V區(qū)片段,除1例未發(fā)現(xiàn)基因突變外,其余17例均發(fā)現(xiàn)2058和2059位點(diǎn)突變,其中A2059G突變10例,A2058G突變5例,A2058T突變2例。結(jié)論23S rRNA基因V區(qū)片段基因突變可能與南京及周邊地區(qū)Mg對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥性相關(guān)。

支原體,生殖器;抗藥性,細(xì)菌;抗菌藥

生殖支原體(Mycoplasma genitalium，Mg)是男性非淋菌性尿道炎(nongonococcal urethritis，NGU)的重要病因之一,特別是在男性非衣原體非淋菌性尿道炎中Mg的患病率更高［1］。目前,國(guó)外性傳播疾病(STD)治療指南推薦大環(huán)內(nèi)酯類抗生素作為治療Mg陽(yáng)性NGU的一線方案［2］,但對(duì)其耐藥的Mg菌株已經(jīng)在澳大利亞、瑞典和挪威的患者中分離出來［3-4］。研究發(fā)現(xiàn),與大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥性相關(guān)的基因突變位于23S rRNA基因V區(qū)。本研究對(duì)就診于我院性病科門診Mg陽(yáng)性的男性NGU患者M(jìn)g進(jìn)行耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)檢測(cè)。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

2012年4-9月就診于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院性病科門診的男性NGU患者。入選標(biāo)準(zhǔn):①年齡滿18周歲;②近2個(gè)月內(nèi)具有持續(xù)性或復(fù)發(fā)性尿道炎史;③近1個(gè)月內(nèi)曾使用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(阿奇霉素、克拉霉素或羅紅霉素);④首次接受治療至本次就診期間無性生活;⑤就診時(shí)具有尿痛、尿路不適、排尿困難、尿道分泌物等尿道炎癥狀;⑥尿道拭子涂片革蘭染色鏡檢多形核白細(xì)胞計(jì)數(shù)(PMNL)≥5/每油鏡視野;⑦無前列腺炎史(無典型臨床癥狀或?qū)嶒?yàn)室證據(jù))。排除標(biāo)準(zhǔn):①尿道拭子涂片或培養(yǎng)淋球菌陽(yáng)性者;②HIV感染者。

二、方法

1.抽樣與標(biāo)本采集:本研究通過中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院倫理委員會(huì)審查同意。采用方便抽樣方法入選研究對(duì)象,所有研究對(duì)象簽署知情同意書后進(jìn)行體檢和標(biāo)本采集。每例患者采集3根尿道拭子和10 ml前段尿。第1根拭子用于革蘭染色涂片、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及排除淋球菌性尿道炎;第2根拭子立即接種于解脲脲原體液體培養(yǎng)基用于檢測(cè)解脲脲原體(Uu);第3根拭子立即凍存于-20℃,供沙眼衣原體(Ct)熒光定量PCR之用。前段尿標(biāo)本立即凍存于-70℃,供生殖支原體PCR檢測(cè)之用。

2.主要試劑與儀器:淋球菌培養(yǎng)基(珠海迪爾生物工程有限公司)、解脲脲原體液體培養(yǎng)基(法國(guó)BioMerieux公司)、沙眼衣原體核酸檢測(cè)試劑盒(廣州中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司)。PCR反應(yīng)酶GoTaq? Green Master Mix(美國(guó)Promega公司)、GeneAmp 9700 PCR儀(美國(guó)ABI公司)、凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

3.淋球菌、沙眼衣原體及解脲脲原體檢測(cè):檢測(cè)操作流程嚴(yán)格按照檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行。

4.生殖支原體檢測(cè):DNA提取采用Chelex-100樹脂(美國(guó)Oxide公司)法,按照文獻(xiàn)［5］方法進(jìn)行。生殖支原體檢測(cè)采用套式PCR方法,按照文獻(xiàn)［6］進(jìn)行。陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物純化后全部送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序,并將測(cè)序結(jié)果與Genbank中的提交序列進(jìn)行BLAST比對(duì)。

5.生殖支原體23S rRNA基因V區(qū)片段擴(kuò)增:Mg陽(yáng)性標(biāo)本中Mg 23S rRNA基因V區(qū)片段擴(kuò)增采用套式PCR方法,外套引物為Mg23S-1986f(5'-GTGTAACCATCTCTTGACTGTCTCGG-3')和Mg23S-2171r(5'-TTCACATCAACAAATCCTTGCGA-3'),內(nèi)套引物為Mg23S-1992F(5'-CCATCTCTTGACTGTC TCGGCTAT-3')和Mg23S-2138R(5'-CCTACCTATT CTCTACATGGTGGTGTT-3')。外套PCR反應(yīng)體系:5 μl模板加入20 μl反應(yīng)液(其中包括上下游引物各 0.5 μmol/L,dNTP 各 200 μmol/L,Taq DNA 聚合酶1 U)中。外套PCR循環(huán):95℃預(yù)變性2 min,然后按95℃45 s,58℃60 s,72℃60 s共35個(gè)循環(huán),最后72℃延長(zhǎng)5 min。外套擴(kuò)增產(chǎn)物用超純水稀釋10倍,取1 μl作為內(nèi)套模板,加入50 μl反應(yīng)液。內(nèi)套PCR循環(huán):95℃預(yù)變性2 min,然后按95℃45 s,55℃ 30 s,72℃30 s共35個(gè)循環(huán),最后72℃延長(zhǎng)5 min。套式PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠(含0.5 mg/L EB)電泳,凝膠成像觀察并記錄結(jié)果。擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期片段為147 bp。陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物純化后全部送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與Genbank中的提交序列進(jìn)行BLAST比對(duì)。

結(jié) 果

一、人口學(xué)資料和STD病史

共調(diào)查門診尿道炎患者264例,91例符合入選標(biāo)準(zhǔn)。年齡18～69歲,平均年齡37.0歲。尿道炎病程7～60 d,平均20.2 d。曾使用過一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(阿奇霉素、克拉霉素或羅紅霉素)治療的有37例(40.7%),曾使用過兩種及以上大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療的有54例(59.3%)。

二、STD檢測(cè)結(jié)果

所有91例均提供標(biāo)本進(jìn)行病原體檢測(cè),54例(59.3%)檢測(cè)到至少1種病原體,其中Mg 21例(23.1%),Ct 18例(19.8%),Uu 10例(11.0%),Mg+Uu 2例(2.2%),Ct+Uu 3例(3.3%),Mg、Ct、Uu均陰性37例(40.7%),無Mg+Ct及Mg+Ct+Uu病例。

三、Mg 23S rRNA基因V區(qū)片段擴(kuò)增結(jié)果

21例Mg陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行23S rRNA基因V區(qū)片段擴(kuò)增,其中18例成功擴(kuò)增出目的基因片段,獲得147 bp大小片段,見圖1。

四、Mg 23S rRNA基因V區(qū)片段擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序和比對(duì)結(jié)果

18例Mg陽(yáng)性標(biāo)本擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與GenBank中的提交序列進(jìn)行BLAST比對(duì)后發(fā)現(xiàn),除1例未發(fā)現(xiàn)23S rRNA基因核苷酸點(diǎn)突變外,其余17例均存在23S rRNA基因核苷酸點(diǎn)突變,其中A2059G突變10例,A2058G突變5例,A2058T突變2例。測(cè)序峰圖見圖2～5。

討 論

Mg是近年來逐漸被人們所認(rèn)識(shí)到一種病原體,許多研究證明,Mg是男性NGU的重要病因［7-8］。由于Mg缺乏細(xì)胞壁,作用于細(xì)胞壁的抗生素,如青霉素類,對(duì)其無效。臨床上多采用干擾蛋白質(zhì)合成的藥物如大環(huán)內(nèi)酯類藥物,以及干擾DNA復(fù)制的藥物如喹諾酮類藥物治療Mg感染。研究表明,阿奇霉素5 d療法(首日500 mg,第2～5天250 mg/d)對(duì)Mg感染患者的清除率較高。因此,國(guó)外STD治療指南將大環(huán)內(nèi)酯類藥物作為目前治療Mg感染的一線方案。

然而隨著大環(huán)內(nèi)酯類藥物廣泛應(yīng)用于治療Mg感染,近年來關(guān)于其耐藥的報(bào)道也越來越多。Bradshaw等［3］采用阿奇霉素1 g頓服方案、或者1 g每周1次口服共3次的方案治療Mg陽(yáng)性的男性NGU患者,發(fā)現(xiàn)高達(dá)28%的患者M(jìn)g持續(xù)陽(yáng)性,分離治療失敗患者體內(nèi)的臨床株進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn),對(duì)阿奇霉素的最低抑菌濃度(MIC)升高,提示其對(duì)阿奇霉素的敏感性降低。最近的幾項(xiàng)研究中［9-10］,阿奇霉素1 g單劑量療法對(duì)患者M(jìn)g感染的清除率僅為67%～84%,這一現(xiàn)象可能反映了人群中已經(jīng)存在對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素具有耐藥性的Mg,也可能反映了阿奇霉素誘導(dǎo)Mg對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥性的出現(xiàn)。

圖1 生殖支原體23S rRNA基因V區(qū)片段擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖1:100 bp DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物;2、3:生殖支原體臨床陽(yáng)性標(biāo)本,147 bp;4:G37標(biāo)準(zhǔn)株,147 bp;5:陰性對(duì)照(ddH2O),無擴(kuò)增

圖2 生殖支原體G37標(biāo)準(zhǔn)株23S rRNA基因V區(qū)片段序列峰圖

圖3 A2059G突變生殖支原體臨床株23S rRNA基因V區(qū)片段序列峰圖

圖4 A2058G突變生殖支原體臨床株23S rRNA基因V區(qū)片段序列峰圖

圖5 A2058T突變生殖支原體臨床株23S rRNA基因V區(qū)片段序列峰圖

細(xì)菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥機(jī)制包括靶位點(diǎn)突變、靶位甲基化修飾、主動(dòng)外排機(jī)制、核糖體蛋白突變和鈍化酶等。目前研究發(fā)現(xiàn),支原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥機(jī)制主要為基因突變導(dǎo)致的靶位點(diǎn)改變,這些研究主要集中在肺炎支原體和解脲支原體［11-12］。這些研究發(fā)現(xiàn),對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥突變位點(diǎn)主要位于23S rRNA基因和核糖體蛋白基因L4和L22基因。目前關(guān)于生殖支原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥機(jī)制的研究較少。Jensen等［4］對(duì)7株從阿奇霉素治療失敗的男性Mg相關(guān)尿道炎的患者體內(nèi)獲得的菌株進(jìn)行體外大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的藥物敏感試驗(yàn),研究Mg對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥分子機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn),Mg23S rRNA V區(qū)位于2 058和2 059位點(diǎn)的點(diǎn)突變與Mg對(duì)阿奇霉素的耐藥性相關(guān)。耐藥性導(dǎo)致非劑量依賴性的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療失敗,而且耐藥性可能是由于阿奇霉素單劑量頓服治療方案的不足量誘導(dǎo)的。研究者認(rèn)為,Mg對(duì)阿奇霉素耐藥性主要是由于在沒有弄清NGU的真正病原菌前提下給予阿奇霉素單劑量治療所誘導(dǎo)的。盡管在其他柔膜細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)L4和L22基因區(qū)突變位點(diǎn)與大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥性相關(guān),該研究發(fā)現(xiàn)L4基因許多點(diǎn)突變發(fā)生,但是大多數(shù)并不導(dǎo)致氨基酸改變,因此不能解釋與耐藥相關(guān)。近來,新西蘭和日本學(xué)者的研究［13-15］也發(fā)現(xiàn),23S rRNA基因A2059G突變與Mg對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥性相關(guān)。同時(shí),通過對(duì)治療前后尿液標(biāo)本中Mg進(jìn)行基因分型發(fā)現(xiàn),發(fā)生耐藥基因突變的Mg菌株都是來自于治療前未發(fā)生耐藥基因突變的高度相近的或完全相同的菌株,是經(jīng)過阿奇霉素治療選擇而來。因此,23S rRNA基因位點(diǎn)突變可能是介導(dǎo)Mg對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥性的主要機(jī)制,阿奇霉素單劑量治療方案可能會(huì)誘導(dǎo)Mg對(duì)大環(huán)內(nèi)脂類抗生素耐藥性的產(chǎn)生。

本研究對(duì)91例持續(xù)性和復(fù)發(fā)性NGU患者病原體進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn),除37例(40.7%)未檢測(cè)到病原體外,Mg感染(25.3%)和Ct感染(23.1%)是最常見的病原菌。Mg、Ct和Uu檢測(cè)均陰性的患者可能是由于神經(jīng)精神因素、變態(tài)反應(yīng)因素等非感染性因素引起,也可能是由于陰道毛滴蟲、單純皰疹病毒或其他臨床少見病原體感染所致［16-17］。

本研究91例患者均為近期接受大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療失敗的患者,且患者自接受治療至本次就診期間無性生活,排除了治療后再感染的可能。因此,標(biāo)本檢測(cè)Mg陽(yáng)性可能是由于其對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥所致。本研究21例Mg陽(yáng)性標(biāo)本中,18例成功擴(kuò)增出目的基因片段,除1例未發(fā)現(xiàn)基因突變外,其余17例均存在23S rRNA基因核苷酸點(diǎn)突變。與既往國(guó)外研究結(jié)果類似,本研究中耐藥基因突變位點(diǎn)位于2058和2059位點(diǎn),其中A2059G突變10例,A2058G突變5例,A2058T突變2例,未發(fā)現(xiàn)其他位點(diǎn)的突變,提示引起南京及周邊地區(qū)STD門診Mg耐藥的主要機(jī)制可能是23S rRNA基因V區(qū)的點(diǎn)突變,2059位點(diǎn)突變占主導(dǎo)位置。A2058T突變?yōu)楸狙芯渴状伟l(fā)現(xiàn),其在Mg對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥性中的具體作用有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。既往有研究報(bào)道,Mg耐藥可能與核糖體蛋白L4和 L22 基因突變相關(guān)［4，14-15］,但是其突變與 A2058G或A2059G同時(shí)發(fā)生,不足以證明與大環(huán)內(nèi)酯類耐藥性相關(guān)。同時(shí),肺炎支原體耐藥性研究發(fā)現(xiàn),與23S rRNA基因V區(qū)突變相比,L4和L22突變僅可能與低水平耐藥相關(guān)。因此,本研究未對(duì)L4和L22基因位點(diǎn)突變進(jìn)行研究。

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Detection of point mutations associated with macrolide resistance inMycoplasma genitalium

Liu Pai，Jiang Juan，Zhang Jinping，You Yongyan，Sha Zhong，Sun Houhua，Gong Kuanglong，Sun Jianfang.Institute of Dermatology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Nanjing 210042，China

s:Jiang Juan，Email:drjjiang@vip.163.com；Sun Jianfang，Email:sunjf57@163.com

Objective To detect point mutations associated with macrolide resistance in the 23S rRNA gene ofM.genitalium.Methods Ninty-one patients with persistent or recurrent urethritis，who had been treated with macrolides in the past one month but achieved no obvious improvement，were included in this study.Urethral swab and first-void urine samples were collected from these patients.Gram's staining，culture and fluorescence-based quantitative PCR were carried out to detectNeisseria gonorrhoeae，Ureaplasma urealyticumandChlamydia trachomatisrespectively in these urethral swab samples，and PCR was performed to detectM.genitaliumin the urine samples.For patients positive to onlyM.genitalium，nested PCR was conducted to amplify the domain V of the 23S rRNA gene followed by direct automatic sequencing，and the resulting sequences were compared to the corresponding sequences ofM.genitaliumG37 strain submitted to the National Center for Biotechnology Information.Results Of the 91 patients，21 were positive forM.genitalium，18 forC.trachomatis，10 forU.urealyticum，2 for bothM.genitaliumandU.urealyticum，3 for bothC.trachomatisandU.urealyticum，and 37 for none of the tested pathogens.The domain V of the 23S rRNA gene，which was amplified from 18 of the 21M.genitalium-positive samples，carried an A to G transition at position 2059 in 10 samples，an A to G transition at position 2058 in 5 samples，an A to T transition at position 2058 in 2 samples，but no point mutations in 1 sample.Conclusion The point mutations in domain V of the 23S rRNA gene may contribute to macrolide resistance inM.genitaliumin Nanjing and its surrounding areas.

Mycoplasma genitalium；Drug resistance，bacterial；Anti-bacterial agents

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.08.005

210042南京,中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所

蔣娟,Email:drjjiang@vip.163.com;孫建方,Email:sunjf57@163.com

2013-11-13)

(本文編輯:顏艷)