羅麗敏 李軍 劉菡 劉勁松 董曉 黨書毅

尾加壓素Ⅱ?qū)ζつw成纖維細(xì)胞表達(dá)Ⅰ型膠原蛋白的影響

羅麗敏 李軍 劉菡 劉勁松 董曉 黨書毅

目的探討血管活性物質(zhì)尾加壓素Ⅱ?qū)θ似つw成纖維細(xì)胞表達(dá)Ⅰ型膠原蛋白及其遷移的影響和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。方法在離體培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞上,用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和Transwell遷移試驗(yàn),觀察尾加壓素Ⅱ?qū)?xì)胞的促分泌和遷移作用。加入不同的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)阻斷劑,觀察其對尾加壓素Ⅱ效應(yīng)的影響。結(jié)果尾加壓素Ⅱ以濃度和時間依賴方式促進(jìn)成纖維細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原蛋白。尾加壓素Ⅱ濃度為10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L的實(shí)驗(yàn)組Ⅰ型膠原蛋白分泌量分別比對照組依次增加21.2%(P＞0.05)、52.2%(P＜0.05)、84.4%(P＜0.05)、83.6%(P＜0.05)和77.1%(P＜0.05)。從4 h開始,Ⅰ型膠原蛋白濃度明顯增加,其分泌量較對照組增加23.2%(P＞0.05)、12 h時增加69.5%(P＜0.05)和24 h時增加84.1%(P＜0.05)。與對照組相比,10-8mol/L尾加壓素Ⅱ組可明顯促進(jìn)細(xì)胞遷移(P＜0.05)。尾加壓素Ⅱ的效應(yīng)能被絲裂原活化的蛋白激酶阻斷劑PD98059、鈣通道阻斷劑尼卡地平和鈣調(diào)素激酶阻斷劑環(huán)孢素A所阻斷,其中對尾加壓素Ⅱ促成纖維細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原蛋白的抑制率依次為18.2%、15.9%、19.7%,對遷移的抑制率為38.3%(P＜0.05)、20.7%(P＜0.05)和81.4%(P＜0.05)。結(jié)論尾加壓素Ⅱ可促進(jìn)人皮膚成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白的分泌和成纖維細(xì)胞的遷移,其促進(jìn)效應(yīng)可能通過Ca2+、鈣調(diào)素激酶以及絲裂原活化的蛋白激酶通路來介導(dǎo)。

血管活性腸肽;尾加壓素Ⅱ;細(xì)胞運(yùn)動;成纖維細(xì)胞;膠原Ⅰ型

人皮膚成纖維細(xì)胞(fibroblast,Fb)是皮膚的重要組成部分,它在多種血管活性物質(zhì)作用下,通過分泌活性因子,參與細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化、增殖、凋亡、遷移及膠原的合成和分泌,在傷口創(chuàng)面愈合、瘢痕組織形成以及皮膚硬化等［1］生理病理過程中起作用［2-4］。有研究表明,Fb表型異常與系統(tǒng)性硬皮病、瘢痕性疾病具有相關(guān)性［1］,Fb已成為治療皮膚功能異常的新靶點(diǎn)［5］。 尾加壓素Ⅱ(urotensinⅡ，UⅡ)是一種新的血管活性肽,在全身各個部位均有分布,其生物學(xué)效應(yīng)廣泛,已有研究證實(shí),UⅡ具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖及表型轉(zhuǎn)化的作用［6］。本研究用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和細(xì)胞遷移試驗(yàn)等技術(shù)手段,觀察UⅡ?qū)b分泌Ⅰ型膠原蛋白及細(xì)胞遷移的影響,初步探討相應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。

材料與方法

一、材料

1.主要試劑:高糖DMEM培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品,胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品,L-谷胺酰胺為美國Hyclone公司產(chǎn)品,Ⅰ型膠原酶為美國Invitrogen公司產(chǎn)品,胰蛋白酶為美國Sigma公司產(chǎn)品,鼠抗人波形蛋白抗體、SP試劑盒及DAB顯色試劑盒為北京中杉公司產(chǎn)品,RatUⅡ?yàn)槊绹鳳hoenix Phann Inc產(chǎn)品,Transwell小室為美國康寧公司產(chǎn)品,環(huán)孢素、尼卡地平和PD98059為德國Biochemical公司產(chǎn)品,余為市售分析純試劑。

2.皮膚標(biāo)本:湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)總醫(yī)院泌尿外科提供4～5歲兒童包皮環(huán)切術(shù)后遺棄的包皮組織。

二、方法

(一)實(shí)驗(yàn)方法:

1.成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng):參考文獻(xiàn)［7］,簡述如下:取包皮,分離表皮與真皮,將真皮片剪成1 mm ×1 mm×1 mm,移入離心管中,加入0.2%Ⅰ型膠原酶溶液吹打均勻,37℃、5%CO2孵箱消化4 h,經(jīng)200目不銹鋼濾網(wǎng)過濾消化液;收集消化液,200×g離心5 min,棄上清,用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞混勻,接種于培養(yǎng)瓶,在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁生長到80%融合,用0.25%胰酶消化傳代。取2～4代細(xì)胞進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

2.細(xì)胞遷移試驗(yàn):將培養(yǎng)細(xì)胞用1.25 g/L胰酶消化,制成細(xì)胞懸液,血細(xì)胞計數(shù)器計數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度。在Transwell小室下室加入含不同濃度UⅡ或含相同濃度UⅡ加不同濃度阻斷劑的DMEM 500 μl,上室接種105Fb懸液,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育6 h后取出上室,以棉簽輕拭去上室濾膜內(nèi)面Fb,對遷移至濾膜外面的Fb用95%冰乙醇固定后,HE染色,隨機(jī)取10個視野(×200)對遷移細(xì)胞計數(shù),取均值作為1次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。重復(fù)3次,取平均值。

3.ELISA:收集經(jīng)不同濃度UⅡ和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)阻斷劑處理后的Fb培養(yǎng)液,用ELISA法檢測培養(yǎng)液中Ⅰ型膠原的含量。首先將待測培養(yǎng)液加入96孔板過夜,然后加鼠抗人Ⅰ型膠原抗體(工作濃度1∶500)37℃2 h,洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(工作濃度1∶1 000)37℃1 h,加入DAB顯色。用酶標(biāo)儀讀取450 nm的吸光度值(A值)。

(二)設(shè)計和分組:不同濃度UⅡ?qū)b分泌Ⅰ型膠原蛋白的影響分為6組:1組為對照組,不加UⅡ;2 ～ 6 組分別為 10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L UⅡ組。不同時間10-8mol/LUⅡ?qū)b分泌Ⅰ型膠原蛋白的影響分為4組,分別在0、4、12、24 h這4個時間點(diǎn)收集培養(yǎng)液。不同信號途徑阻斷劑對10-8mol/L UⅡ?qū)b分泌Ⅰ型膠原蛋白效應(yīng)的影響分為5組:①對照組:不加任何處理因素;②UⅡ組:只加UⅡ;③UⅡ +10-5mol/L PD98059組;④UⅡ +10-5mol/L尼卡地平組;⑤UⅡ+10-5mol/L環(huán)孢素組。

參考上述實(shí)驗(yàn),選擇10-8mol/L UⅡ、培養(yǎng)24 h時間點(diǎn),觀察不同信號途徑阻斷劑對UⅡ促細(xì)胞遷移作用效應(yīng)的影響,分為5組,分組處理同上。

(三)統(tǒng)計分析:用GraphPad Prism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計量資料用±s表示,兩組之間均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、不同濃度UⅡ?qū)b分泌Ⅰ型膠原蛋白的影響

不同濃度UⅡ刺激Fb 24 h后,收集細(xì)胞培養(yǎng)液,使用ELISA測定培養(yǎng)液中Ⅰ型膠原蛋白的含量。結(jié)果提示,隨著UⅡ濃度的增加,Fb分泌的Ⅰ型膠原蛋白亦增加。10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L UⅡ組Ⅰ型膠原蛋白分泌量分別較對照組增加21.2%、52.2%、84.4%、83.6%和77.1%。 見圖1。

二 UⅡ作用不同時間對Fb分泌Ⅰ型膠原蛋白的影響

見圖2。使用10-8mol/L UⅡ刺激FB 4～24 h,收集細(xì)胞培養(yǎng)液,ELISA法測定培養(yǎng)液中Ⅰ型膠原蛋白的含量。結(jié)果顯示,從4 h開始,Ⅰ型膠原蛋白濃度明顯增加,4、12、24 h后其分泌量分別較對照組增加23.2%、69.5%和84.1%。

三、不同信號通路阻斷劑對UⅡ刺激Fb分泌Ⅰ型膠原蛋白的影響

圖1 不同濃度尾加壓素Ⅱ?qū)θ似つw成纖維細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原蛋白的影響 1組為對照組,不加UⅡ;2～6組分別為10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L UⅡ組;a:與對照組相比,P ＜ 0.05(n=5)

圖2 尾加壓素Ⅱ作用不同時間對人皮膚成纖維細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原蛋白的影響;a:與對照組相比,P＜0.05(n=5)

圖3 不同信號通路阻斷劑對UⅡ促人皮膚成纖維細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原蛋白的影響 1組:對照組;2組:UⅡ組;3組:UⅡ+10-5 mol/L PD98059組;4組:10-5mol/L尼卡地平組;5組:UⅡ+10-5 mol/L環(huán)孢素組;a:與對照組相比,P＜0.05;b:與UⅡ組相比,P＜0.05(n=5)

見圖3。用不同信號通路阻斷劑PD98059(10-5mol/L),尼卡地平(10-5mol/L),環(huán)孢素(10-5mol/L)預(yù)處理Fb 30 min后,再使用10-8mol/L UⅡ刺激Fb 24 h,收集細(xì)胞培養(yǎng)液,ELISA法測定培養(yǎng)液中Ⅰ型膠原蛋白的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),UⅡ刺激Fb分泌Ⅰ型膠原蛋白的作用能夠被PD98059、尼卡地平和環(huán)孢素所抑制,其抑制率依次為18.2%、15.9%和19.7%。

四、不同信號通路阻斷劑對UⅡ刺激Fb遷移的影響

UⅡ刺激Fb遷移的作用能夠被PD98059、環(huán)孢素和尼卡地平所抑制,其抑制率依次為38.3%、81.4%和20.7%。見圖4。

討 論

Fb是皮膚真皮結(jié)締組織中的主要細(xì)胞,可分泌膠原蛋白、彈性蛋白,從而形成膠原纖維和彈性纖維;也可分泌葡聚糖、纖連蛋白、糖蛋白及透明質(zhì)酸等細(xì)胞外基質(zhì)成分。在皮膚損傷后的愈合過程中,Fb起著主要作用。

UⅡ是一種新的血管活性肽［8］,從軟體動物到人均有分布,1998年被首次發(fā)現(xiàn)在人體表達(dá),在全身各個部位均有分布。研究表明,它是一種既能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖,又能夠促進(jìn)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的活性因子。UⅡ能夠以濃度依賴性方式促進(jìn)血管外膜成纖維細(xì)胞表達(dá)α平滑肌肌動蛋白,向肌成纖維細(xì)胞表形轉(zhuǎn)化,并促進(jìn)成纖維細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原及細(xì)胞遷移［8］。這些作用可以通過促有絲分裂蛋白激酶MAPK、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶、Rho以及蛋白激酶C、鈣通道等途徑來實(shí)現(xiàn)［6，9-10］。從肽類生長因子調(diào)控皮膚各種病理生理作用的角度而言,UⅡ可能有助于揭示Fb在皮膚損傷愈合過程中的作用機(jī)制。

圖4 不同信號通路阻斷劑對UⅡ促人皮膚成纖維細(xì)胞遷移的影響 1組:對照組;2組:UⅡ組;3組:UⅡ+10-5mol/L PD98059組;4組:UⅡ+10-5mol/L環(huán)孢素組;5組:10-5mol/L尼卡地平組;a:與對照組相比,P＜0.05;b:與UⅡ組相比,P＜0.05(n=10)

本研究在體外培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞中,發(fā)現(xiàn)UⅡ以時間和濃度依賴性的方式促進(jìn)Fb產(chǎn)生和分泌Ⅰ型膠原蛋白,此作用能被鈣通道阻斷劑尼卡地平、鈣調(diào)素激酶阻斷劑環(huán)孢素和絲裂原活化蛋白激酶阻斷劑PD98059所阻斷,提示UⅡ能夠促進(jìn)皮膚Fb直接合成和分泌Ⅰ型膠原蛋白,該作用可能通過Ca2+、鈣調(diào)素激酶以及絲裂原活化蛋白激酶等多條途徑來實(shí)現(xiàn)。同時發(fā)現(xiàn),在UⅡ濃度為10-8mol/L,時間為24 h這個時間點(diǎn)上,UⅡ能促進(jìn)Fb遷移,且在不同程度被上述通道阻斷劑抑制,說明Fb的遷移作用能被UⅡ介導(dǎo),Ca2+、鈣調(diào)素激酶及MAPK等通路參與其中。Fb活性增加,發(fā)生表型轉(zhuǎn)化,分泌膠原蛋白增多和遷移是皮膚損傷后愈合的重要環(huán)節(jié),在傷口創(chuàng)面愈合、瘢痕組織形成和系統(tǒng)性硬皮?。?］等疾病的發(fā)生發(fā)展過程中具有十分重要的意義,因此UⅡ?qū)b的這種促分泌和促趨化效應(yīng)值得深入研究。

本試驗(yàn)所展示的UⅡ可以誘導(dǎo)Fb遷移和膠原分泌,并且與Ca2+、鈣調(diào)素激酶及MAPK等通路相關(guān),提示UⅡ是一種新的Fb活性刺激劑,它可通過自分泌和旁分泌方式來實(shí)現(xiàn)與其他生物活性因子之間的調(diào)節(jié)過程。

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Effects of urotensin Ⅱ on the expression of typeⅠ collagen in human skin fibroblasts

Luo Limin*，Li Jun，Liu Han，Liu Jinsong，Dong Xiao，Dang Shuyi.*Department of Dermatology，Dongfeng General Hospital，Hubei University of Medicine，Shiyan 442000，Hubei，China

Li Jun，Email:stulijun@sina.com

Objective To evaluate the effect of a vasoactive substance urotensin Ⅱ on the expression of typeⅠ collagen and migration of human skin fibroblasts，and to explore the underlying mechanisms of signal transduction.Methods Fibroblasts were isolated from human foreskin tissues and subjected to primary culture.After a series of subculture，fibroblasts were classified into several groups to be treated with different concentrations(10-10to 10-6mol/L)of urotensin Ⅱ for 24 hours，urotensin Ⅱ of 10-8mol/L for different durations(0，4，12，24 hours)，or pretreated with PD98059(a mitogen-activated protein kinase kinase inhibitor)，nicardipine(a calcium channel blocker)and ciclosporin(a calcineurin inhibitor)of 10-5mol/L respectively for 30 minutes followed by treatment with urotensinⅡ of 10-8mol/L for 24 hours.The cells receiving no treatment served as the control.Subsequently，enzyme-linked immunosorbent assay was performed to determine the level of urotensin Ⅱ in the supernatant of fibroblasts，and Transwell assay to estimate the migration activity of fibroblasts.Statistical analysis was carried out byttest and analysis of variance.Results UrotensinⅡ promoted the expression of typeⅠ collagen in a time-and concentrationdependent manner.The level of typeⅠ collagen was increased by 21.2%(P＞0.05)，52.2%(P＜0.05)，84.4%(P＜0.05)，83.6%(P＜ 0.05)and 77.1%(P＜ 0.05)in the supernatant of fibroblasts treated with 10-10，10-9，10-8，10-7and 10-6mol/L of urotensinⅡ for 24 hours respectively，by 23.2%(P＞0.05)，69.5%(P＜0.05)and 84.1%(P＜0.05)in the supernatant of fibroblasts treated with urotensin Ⅱ of 10-8mol/L for 4，12 and 24 hours respectively，compared with the untreated control fibroblasts.The migration activity was markedly enhanced in fibroblasts treated with urotensinⅡ of 10-8mol/L for 24 hours compared with the control fibroblasts(P＜0.05).PD98059，nicardipine and cyclosporin A inhibited the secretion of typeⅠ collagen by 18.2%，15.9%and 19.7%respectively，and suppressed the migration of fibroblasts by 38.3%(P＜0.05)，20.7%(P＜0.05)and 81.4%(P＜0.05)respectively in the groups receiving pretreatment compared with those treated with urotensinⅡalone.Conclusions UrotensinⅡ can promote the secretion of typeⅠ collagen by and migration of fibroblasts，which may be realized through the Ca2+，calmodulin kinase，and mitogen-activated protein kinase pathways.

Vasoactive intestinal peptide；Urotensin Ⅱ；Cell movement；Fibroblasts；Collagen typeⅠ

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.08.010

湖北省自然科學(xué)基金(2011CDC049);湖北省教育廳科研項目(B20102104);十堰市科技局科研基金(2010st39)

442000武漢,湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)總醫(yī)院皮膚科(羅麗敏、劉菡、劉勁松);湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院心內(nèi)科(李軍、董曉、黨書毅)

李軍,Email:stulijun@sina.com

2013-11-18)

(本文編輯:吳曉初)