孫 田, 劉曉明, 張振穎

孢子絲菌病在世界范圍內(nèi)廣泛分布[1]，國(guó)內(nèi)各地均有本病的報(bào)道[2]。本病診斷目前主要依靠臨床表現(xiàn)及病原菌的分子生物學(xué)鑒定。孢子絲菌的相對(duì)特異性探針[3-5]為孢子絲菌病的分子生物學(xué)診斷奠定了基礎(chǔ)，但尚無(wú)資料對(duì)各探針進(jìn)行系統(tǒng)地比較。本研究旨在用聚合酶鏈反應(yīng)-酶聯(lián)免疫（PCR-ELISA）的方法在現(xiàn)有報(bào)道的探針?lè)N類中篩選出結(jié)合效率較高的孢子絲菌特異性探針，為快速、準(zhǔn)確的診斷孢子絲菌病提供臨床參考。

1 材料和方法

1.1 菌株來(lái)源

來(lái)自不同地區(qū)和不同臨床分型孢子絲菌病的申克孢子絲菌50 株，其中大連37 株，上海5 株，北京4 株，長(zhǎng)春2 株，南京1 株，美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)標(biāo)本(American type culture collection) 保存菌株ATCC10268 1 株（表1）。念珠菌、毛霉、煙曲霉各1 株，均為大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科真菌室保存菌種。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試劑 基因組DNA 提取液CTAB [2%(W:V)十六烷基三甲基溴化物，100 mmol/L Tris-HCl，1.4 mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA]，LA Taq 酶（5U/μl）購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，PCR-ELISA 試劑盒購(gòu)自德國(guó)Roche 公司。

表1 50株孢子絲菌菌株的來(lái)源及臨床類型

1.2.2 基因組DNA 提取 將所有臨床分離株接種于SDA 液體培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)2 周，采用Graham 等[6]的CTAB 法提取真菌基因組DNA，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA 含量。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增目的片段 以真菌通用引物NS1(18SrDNA 的部分堿基) 作為引物1 (5'-GTAGTC ATATGCTTGTCTC-3')，參照GeneBank 中5 株孢子絲菌核糖體保守區(qū)28SrDNA 3'端的基因序列設(shè)計(jì)引物2（5'-TTGGTCCGTGTTTCAAGACG-3'）；PCR 反 應(yīng)體 系：10×buffer 5 μl，dNTPs 4 μl，Taq 酶0.25 μl，各 菌 株DNA 1 μl(約70 ng)，引 物 各1 μl，dd H2O 37.75 μl；循環(huán)條件：96℃預(yù)變性1 min；95℃ 40's，52℃ 1 min，72 ℃ 2 min 擴(kuò)增30 個(gè)循環(huán)；最后一個(gè)循環(huán)后于72 ℃延伸7 min。產(chǎn)物鑒定：取5 μl 產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳，并取適量產(chǎn)物送至上海生物工程有限公司進(jìn)行純化測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在基因庫(kù)網(wǎng)上查詢，并用Clustal 軟件比較分析，擴(kuò)增出編碼核糖體（18S、5.8S、28SrRNA）及其內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS1、ITS2）的基因片段（圖1）。

圖1 引物和探針雜交位點(diǎn)示意圖

1.2.4 PCR-ELISA 合成一段以擴(kuò)增PCR 產(chǎn)物片段內(nèi)ITS3 基因?yàn)榘邢虻奶结?，并以生物素?biāo)記，利用此探針結(jié)合上述DNA 片段使其固定在包被親和素的 96 孔板上（DNA 片段-探針*生物素---親和素-96 孔板），分別加入5 個(gè)地高辛標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，以底物顯色者記為陽(yáng)性，記錄顯色與否、顯色強(qiáng)弱及酶標(biāo)儀讀取的吸光度（圖2）[3]?？晒┖Y選的孢子絲菌特異性探針序列[3,5,6]分別為針對(duì)28SrRNA 的 U26852：5'-Digoxigenin CGGACCACCCGGCG-3'；U26866：5'-Digoxigenin CGGCGGCATGCCCC-3'；U26866'：5'-Digoxigenin GTGGTCCGCGAGGCGCAA-3'；針 對(duì)18SrRNA 的M85053：5'-Digoxigenin GCGCTGCCAAAGCAACGC-3'；針對(duì)ITS2 區(qū)的AF117945：5'-Digoxigenin GACGCGCAGCTCTTTTTA-3'。用于與包被親和素的96 孔板結(jié)合的探針序列[3]為：ITS3-B：5'-Biotin GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'，合成于大連寶生物工程有限公司。雜交過(guò)程按PCR-ELISA 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。每孔讀取405 nm 波長(zhǎng)下的吸光度（參考波長(zhǎng)為492 nm），每?jī)蓚€(gè)平行樣品的吸光度（A）值取平均數(shù)。A 值的修正：EI=A（待測(cè)DNA）/A（H2O）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，各種探針的EI 值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間總的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q 檢驗(yàn)（LSD 法），P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 PCR-ELISA原理示意圖

2 結(jié)果

2.1 PCR 產(chǎn)物的鑒定

以真菌通用引物NS1 和筆者自行設(shè)計(jì)的引物2對(duì)50 株孢子絲菌菌株進(jìn)行擴(kuò)增，均擴(kuò)增出編碼核糖體（18S、5.8S、28SrRNA）及其內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS1、ITS2）的基因片段約3 000 bp（圖3）。經(jīng)序列測(cè)定和比較，5 個(gè)待篩選探針及ITS3 探針的堿基序列均位于該DNA 片段上。

圖3 50株孢子絲菌18SrDNA-28SrDNA的PCR片段凝膠電泳圖

2.2 探針的結(jié)合效率檢測(cè)結(jié)果

在相同的雜交和ELISA 條件下，以ATCC10268為陽(yáng)性對(duì)照，毛霉、煙曲霉、念珠菌各1 株為陰性對(duì)照，雙蒸滅菌水為空白對(duì)照，50 株孢子絲菌均對(duì)探針U26852 顯色較強(qiáng)，對(duì)其他4 個(gè)探針則顯色較弱。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，U26852 的EI=15.29±3.88，U26866 的EI=1.36±0.21，AF117945 的EI=1.12 ±0.12， M85053的EI=1.13 ±0.13， U26866'的EI=1.42±0.22，各組間總的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=650.317，P ＜0.05），組間兩兩比較顯示，U26852 的EI 值與其他4 個(gè)探針比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其余各組間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。毛霉、煙曲霉、念珠菌對(duì)5 個(gè)探針EI 值均偏低（0.97 ～1.02），雙蒸滅菌水為1。

3 討論

孢子絲菌的基因組DNA 由30 萬(wàn)左右個(gè)堿基組成，確定各部位的功能已經(jīng)成為未來(lái)研究的方向和目標(biāo)。國(guó)內(nèi)外在基因診斷方面，目前側(cè)重于比較多種致病性真菌間的差異而尋找單一的探針和引物。由于真菌核糖體DNA（rDNA）基因的部分區(qū)域在進(jìn)化上高 度保守，而在其他區(qū)域又存在著足夠的變異，因此利用rDNA 基因進(jìn)行探針的設(shè)計(jì)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。Sandhu 和 Lindskey 等[3,4]通過(guò)與其他深部真菌和淺部真菌及細(xì)菌進(jìn)行對(duì)比，設(shè)計(jì)出針對(duì)18srRNA、28s rRNA、ITS2 區(qū)的孢子絲菌相對(duì)特異性探針，為孢子絲菌病的分子生物學(xué)診斷奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本研究首次對(duì)已報(bào)道的多種孢子絲菌特異性探針進(jìn)行篩選，以得到結(jié)合效率較高的探針。

1992 年Sano 等[7]首次報(bào)道了免疫PCR 技術(shù)，該方法將血清學(xué)中的抗原抗體反應(yīng)，與聚合酶鏈反應(yīng)特異擴(kuò)增一段DNA 分子的技術(shù)結(jié)合起來(lái)，用一段具體的DNA 分子標(biāo)記抗體去檢測(cè)抗原，PCR 擴(kuò)增此段DNA 分子，電泳定性，根據(jù)此段DNA 分子是否存在，來(lái)顯示抗原是否存在[8]。

Lindsley 等[3]將免疫PCR 方法進(jìn)行了改良，利用生物素與親和素之間強(qiáng)大的特異性結(jié)合原理，將PCR 產(chǎn)物借助生物素標(biāo)記的該片段探針結(jié)合到包被親和素的96 孔板上，同時(shí)加入地高辛抗原標(biāo)記的特異性探針進(jìn)行雜交，反應(yīng)洗板后加入酶標(biāo)記的地高辛抗體和顯色底物，通過(guò)顯色強(qiáng)弱和酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，成功地用特異性寡核酸探針快速鑒定了9 種雙相型和酵母樣真菌病原體。Elie 等和Fujita 等[9,10]通過(guò)免疫PCR 的方法應(yīng)用種特異性探針快速鑒定了念珠菌屬的部分菌種。朱利平等[11]用微孔板雙探針雜交法快速鑒別了都柏林念珠菌和白念珠菌。該方法具有PCR 和生物素-親和素雙重放大系統(tǒng)，具有較高的結(jié)合效率。PCR-ELISA 技術(shù)以其快速、靈敏、特異、可批量檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已被廣泛的應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因食品、病原微生物的檢測(cè)中，并取得了很大的成果[12]。

我們采用Lindsley 等[3]改良后的PCR-ELISA 方法，以50 株孢子絲菌菌株為樣本進(jìn)行5 個(gè)特異性探針的篩試。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中筆者發(fā)現(xiàn)，對(duì)于探針U26852，在一定濃度范圍內(nèi)，EI 值不隨待篩選探針的濃度增大而增大，而隨PCR 產(chǎn)物濃度的增大而增大。我們擴(kuò)增得到的PCR 產(chǎn)物濃度為16 ～30 ng/μl，EI 值8.54 ～24.11。其他4 個(gè)探針均結(jié)合效率較差且樣本之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而進(jìn)一步測(cè)序時(shí)發(fā)現(xiàn)5 個(gè)探針與標(biāo)準(zhǔn)株核糖體基因序列均具很好的同源性。由此筆者認(rèn)為PCR 產(chǎn)物與探針的DNA 空間構(gòu)象可能影響二者結(jié)合，僅憑顯色強(qiáng)弱來(lái)確定探針的結(jié)合效率尚存一定缺陷?；诖耍覀冎謱?duì)5 個(gè)探針雜交靶位的32 株孢子絲菌臨床分離株（不同基因型別）核糖體基因序列進(jìn)行測(cè)定，以期通過(guò)比較探針與靶位同源性的高低來(lái)解釋探針敏感性差異的原因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)32 株菌株的探針雜交靶位核糖體基因序列并無(wú)差異，故該現(xiàn)象的產(chǎn)生原因有待進(jìn)一步探討。本方法仍停留在培養(yǎng)基菌落的DNA 提取和擴(kuò)增，未能進(jìn)行臨床標(biāo)本的直接檢測(cè)，故其實(shí)用價(jià)值有待進(jìn)一步提高。

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