田 軍，朱龍飛，堅 哲，劉邦民，李 強，李春英，高天文

白癜風是一種常見的色素脫失性疾病，臨床上主要表現(xiàn)為皮損處色素消失[1]。目前，關于白癜風的病因尚不清楚，其皮損處黑素細胞被破壞的機制也較復雜[2]。因此，了解和掌握白癜風具體發(fā)病機制對預防和治療白癜風具有重要的意義。以往研究認為，白癜風的發(fā)生與遺傳、內分泌、自身免疫等諸多因素有關，近年來越來越多的研究顯示氧化應激在其發(fā)病中起關鍵作用，而通常認為起關鍵作用的自身免疫因素則可能是氧化應激導致黑素細胞被破壞后的繼發(fā)現(xiàn)象[3]。氧化應激可以產(chǎn)生活性氧簇（reactive oxygen species, ROS），它包括各種氧自由基，其中H2O2是主要成員，它可以直接或間接的損傷細胞，誘導細胞凋亡和壞死[4]。有研究表明，H2O2的過量蓄積是氧化應激參與白癜風發(fā)病最直接的證據(jù)之一[5]。然而由于缺乏合適的實驗模型，目前白癜風的研究較為困難。因此，我們采用人永生化黑素細胞系PIG1 為研究對象，以H2O2作為誘發(fā)氧化應激損傷的因素，建立體外模擬 ROS 誘導氧化應激的細胞模型，為研究白癜風氧化應激發(fā)病機制打下基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人永生化黑素細胞系PIG1 由美國芝加哥大學Caroline Le Poole 教授饋贈，254 培養(yǎng)基（Invitrogen公司），胰蛋白酶、胎牛血清（Gibco BRL 公司），CCK-8 細胞活性檢測試劑盒及ROS 檢測試劑盒（碧云天公司），Annexin V-FITC / PI 細胞凋亡試劑盒（麥博公司），丙二醛（MDA）檢測試劑盒（南京建成公司），H2O2等其他試劑均為國產(chǎn)分析純。倒置顯微鏡（NikonES2000），酶標儀（BIORAD680 型），流式細胞儀FACS Calibur（BD 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及處理 PIG1 細胞培養(yǎng)于含 5%胎牛血清254 培養(yǎng)基中，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于實驗，0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞，按 1×106/ml 密度接種于 96 孔或 6 孔板中，培養(yǎng)至細胞貼壁約 80%時分組處理。分別用H2O2終濃度為 0、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、2.00 mmol/L 的培養(yǎng)基培養(yǎng) PIG1 細胞24 h，進行下一步實驗。

1.2.2 細胞形態(tài)觀察 倒置顯微鏡觀察處理后各組細胞的形態(tài)學變化。

1.2.3 細胞凋亡檢測 消化收集各組細胞，分別加入100 μl Binding Buffer 和Annexin V-FITC（20 μg/ml）10 μl，室溫避光30 min，再加入PI（50 μg/ml）5 μl，避光反應5 min 后，加入400 μl Binding Buffer，流式細胞儀檢測凋亡率，以不加Annexin V-FITC 及PI 各一管作為陰性對照。

1.2.4 細胞內ROS 水平檢測 去除已處理好的 6 孔板中培養(yǎng)基， PBS 洗滌1 次，每孔加入1 ml 按照1∶1 000 無血清254 培養(yǎng)基稀釋的ROS 熒光探針DCFH-DA，孵育20 min，棄上清后PBS 洗滌3 次，消化收集各組細胞，800 r/min，離心5 min，PBS 洗滌3 次，流式細胞儀檢測平均熒光強度。

1.2.5 細胞活性檢測 向已處理好的 96 孔板每孔加入10 μl CCK-8 試劑，37 ℃，5% CO2孵箱中孵育 1 h 后，酶標儀測定 490 nm 處各孔A 值，計算公式：細胞活性= A490(處理組)/ A490(對照組)×100% 。

1.2.6 MDA 檢測 采用硫代硫酸巴比妥法（TBARs），每組均取 1×106個處理好的細胞，3 000 r/min，離心 10 min，棄上清，在沉淀中加入 0. 6 ml 雙蒸水，置旋渦混勻器上混勻 1 min，加 0.3 ml 無水乙醇，混勻 30 s，加三氯甲烷 0.3 ml，混勻 1 min，3 500 r/min，離心 10 min 后吸取上層MDA 抽提液0. 8 ml，試劑盒檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 不同濃度H2O2 處理后黑素細胞形態(tài)學變化

不同濃度H2O2處理后黑素細胞形態(tài)學變化見圖1。倒置顯微鏡下觀察顯示正常的黑素細胞形態(tài)呈樹突狀，兩極、三極或多極，部分區(qū)域連接成網(wǎng)狀。隨著作用濃度的增加，黑素細胞體積變小，樹突數(shù)量減少，長度縮短，凋亡及壞死逐漸增加。

圖1 不同濃度H2O2處理24 h后黑素細胞形態(tài)學變化

圖2 不同濃度H2O2 對人黑素細胞凋亡的影響

圖3 不同濃度H2O2 對人黑素細胞內ROS的影響

2.2 不同濃度H2O2 對PIG1 細胞凋亡情況的影響

不同濃度H2O2對PIG1 細胞凋亡情況的影響見圖2。流式細胞儀凋亡分析結果顯示，在 0.50 mmol/L H2O2處理組黑素細胞就開始發(fā)生凋亡，隨著 H2O2濃度的增加，PIG1 細胞凋亡率逐漸增高，0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、和 2.00 mmol/L H2O2處理24 h 后， PIG1 細胞的總凋亡率分別為6.8%、11.5%、15.6%、22.7%、38.7% 和57.5%。

2.3 不同濃度H2O2 對PIG1 細胞內ROS 產(chǎn)生的影響

不同濃度H2O2對PIG1 細胞內ROS 產(chǎn)生的影響見圖3。實驗發(fā)現(xiàn)H2O2對 PIG1 細胞內ROS 產(chǎn)生的影響存在濃度依賴關系，隨著H2O2濃度的增加，PIG1 細胞內ROS 水平逐漸升高。以 0 mmol/L 濃度組作為對照相比，0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、2.00 mmol/L H2O2處理組PIG1 細胞24 h 后平均熒光強度 分 別 為 （269.8±11.46）、（315.0±1.27）、（450.1±3.75）、（856.5±46.4）、（1216.0±19.2）、（1714±109.2），從1.00 時開始具有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。

2.4 不同濃度H2O2 對PIG1 細胞活性的影響

不同濃度H2O2對PIG1 細胞活性的影響見表1。H2O2對 PIG1 細胞活性的影響存在濃度依賴關系，隨著H2O2濃度增加，PIG1 細胞的生長活力逐漸降低，從1.0 mmol/L 時開始具有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。

2.5 不同濃度H2O2 對PIG1 細胞MDA 產(chǎn)生的影響

不同濃度H2O2對PIG1 細胞MDA 產(chǎn)生的影響見表2。隨著H2O2濃度的增加，PIG1 細胞MDA 產(chǎn)生量逐漸增加，從1.00 mmol/L 時開始具有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。

表1 不同濃度H2O2 對人黑素細胞活性的影響 ±s）

表1 不同濃度H2O2 對人黑素細胞活性的影響 ±s）

注 ：與對照組比較，* P<0.05

0.50 98.0±2.02 0.412 H2O2濃度(mmol/L) 活性率(%) P值（與對照組比）0 101.7±2.61 0.75 95.2±1.83 0.050 1.00 79.7±4.28* 0.000 1.25 57.1±3.09* 0.000 1.50 46.9±1.94* 0.000 2.00 28.6±2.54* 0.000

表2 不同濃度H2O2 對人黑素細胞MDA產(chǎn)生的影響 ±s）

表2 不同濃度H2O2 對人黑素細胞MDA產(chǎn)生的影響 ±s）

注 ：與對照組比較，* P<0.05

H2O2濃度(mmol/L) MDA P值（與對照組比）0 101.7±2.61 0.50 98.0±2.02 1.000 0.75 95.2±1.83 0.512 1.00 79.7±4.28* 0.001 1.25 57.1±3.09* 0.000 1.50 46.9±1.94* 0.000 2.00 28.6±2.54* 0.000

3 討論

人體皮膚在正常情況下，表皮細胞內自由基的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，細胞會受到自由基防御系統(tǒng)和損傷修復系統(tǒng)的雙重保護[6]。細胞有氧代謝會產(chǎn)生少量H2O2、HO- 等活性氧自由基，黑素細胞合成黑素的過程中及紫外線的照射也會引起表皮 H2O2的蓄積。H2O2可產(chǎn)生羥自由基，引起脂質過氧化反應，還可以自由穿過細胞膜和核膜，因此對細胞的損傷最大。皮膚在受到外源性毒物、藥物或各種有害刺激時亦可產(chǎn)生大量的氧自由基，當自由基的產(chǎn)生超出機體清除能力時，就會產(chǎn)生氧化應激[7]。目前大量研究表明白癜風的發(fā)生與氧化應激損傷密切相關，其中最直接最有力的證據(jù)就是有國外學者在進展期白癜風患者表皮中檢測到了過量蓄積的H2O2[5]。

通過查閱以往的文獻，筆者選擇了6 個H2O2處理濃度 (0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、2.00 mmol/L) 和作用時間 (24 h)。實驗中發(fā)現(xiàn)，隨著H2O2處理濃度的升高，黑素細胞活性逐漸下降，細胞凋亡比率逐漸升高，細胞內ROS 和MDA 產(chǎn)生逐漸增加，存在著明顯的劑量依賴關系。1.00 mmol/L 的H2O2作用于PIG1 細胞 24 h 后，細胞活性、細胞內ROS 及MDA水平改變差異有統(tǒng)計學意義，同時細胞凋亡率也不高，這說明在此濃度作用下細胞既可以產(chǎn)生氧化應激狀態(tài)又不至于死亡過多，還可進行下一步的干預和培養(yǎng)，因此我們確定1.00 mmol/L 的H2O2處理24 h 為最佳實驗濃度。

在H2O2復制的人黑素細胞氧化性損傷模型中，細胞的氧化損傷較為明顯，表現(xiàn)為細胞活性下降，細胞凋亡比率增加，細胞內ROS 及脂質過氧化產(chǎn)物MDA 含量均增高。細胞活性下降和凋亡比率升高是H2O2對細胞造成不可逆損傷的充分體現(xiàn)；ROS 水平直接反映了細胞內氧化應激的程度[8]；MDA 是細胞生物膜中的不飽和脂肪酸被氧化后的代謝產(chǎn)物，其產(chǎn)量的多少可以反映細胞脂質過氧化的程度，從而間接反映氧化應激損傷的程度[9]。既往已有研究證實H2O2可以引起劑量依賴性細胞死亡，但濃度較低時主要導致細胞凋亡，濃度過高則主要引起細胞壞死[10,11]。本研究發(fā)現(xiàn)1.00 mmol/L H2O2處理 24 h 后細胞活性開始下降，與對照組相比組間差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），從其他方面看1.00 mmol/L H2O2處理24 h 后對細胞的損害不大，但從細胞凋亡率來看1.00 mmol/L H2O2處理24 h 后就開始誘發(fā)了明顯的細胞凋亡和壞死，其中占主要部分的是凋亡。通過以上結果可以發(fā)現(xiàn)，隨著H2O2濃度的增加細胞可出現(xiàn)明顯的損傷效應，先是細胞功能的改變，損傷積累到一定程度就觸發(fā)了細胞的器質性損害或不可逆的損傷。

以往有作者使用黑素瘤細胞系及原代黑素細胞建立氧化應激模型進行白癜風氧化應激損傷相關機制研究[12,13]。筆者在此基礎上進一步改進，采用人永生化黑素細胞系PIG1 作為建模對象，其具有完善的黑素代謝功能及其他生物學特性[14]，更接近于人原代黑素細胞，因而具有較強特異性；也能最大限度的克服原代黑素細胞因取材個體年齡等異質性而導致的誘導條件不穩(wěn)定，因而具有很強的穩(wěn)定性；H2O2的處理濃度接近于白癜風患者表皮中H2O2的濃度[15]，所造成的氧化損傷過程類似于體內ROS 導致黑素細胞氧化損傷的病理過程，所以模擬性很強；另外本模型的可控性強，較原代培養(yǎng)來說，細胞系便于操作，易于重復。但由于該細胞系是經(jīng)人乳頭瘤病毒(HPV)-6 型病毒轉染的永生化細胞系，其可能與原代培養(yǎng)的黑素細胞存在差異，因此具有一定的局限性，故用于實驗研究時還需與原代培養(yǎng)的黑素細胞結合起來，相互印證，相互補充。

綜上所述，筆者的研究建立了H2O2誘導 PIG1 細胞氧化應激損傷模型，本細胞氧化損傷模型簡易，經(jīng)濟，便于推廣，能較好地模擬氧自由基誘導的細胞死亡，為從細胞水平深入研究黑素細胞氧化應激相關疾病提供了良好的模型支持。

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