薛洪寶， 張 暉*， 梁麗麗， 楊俊松， 申 林， 陶兆林

（1.蚌埠醫(yī)學(xué)院 化學(xué)教研室，安徽 蚌埠 233030；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院 科研中心，安徽 蚌埠233030）

隨著全球食品工業(yè)的日益發(fā)展，消費(fèi)者對(duì)食品安全提出的要求越來(lái)越高，但近些年國(guó)內(nèi)外食品安全惡性事件屢有發(fā)生，對(duì)人類健康威脅嚴(yán)重，食品安全問題已經(jīng)成為當(dāng)今世界關(guān)注的熱點(diǎn)之一[1]。高效毛細(xì)管電泳（HPCE）擁有色譜和電泳技術(shù)的共同優(yōu)點(diǎn)，具有諸多高效分離模式，可以在很大程度上滿足基體復(fù)雜的食品分析要求[2]。因此，HPCE在食品分析方面的應(yīng)用日趨廣泛。

紐甜、阿斯巴甜、甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜等人工合成甜味劑由于甜度高、用量少，具有高效、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，常用以代替蔗糖添加到食品中[3]；此類食品添加劑具有熱值小，多不參與代謝，口味好，尤其博得肥胖、糖尿病、高血壓、齲齒等患者的青睞[4]。為了改善食品口味、風(fēng)味等，生產(chǎn)商往往在一種食品中同時(shí)添加多種甜味劑。但每種甜味劑都有一定的使用范圍和添加限量，如果過量使用會(huì)影響身體健康[5-6]，長(zhǎng)期攝入可能造成機(jī)體損傷[7]。目前，檢測(cè)食品中甜味劑的常用方法有：高效液相色譜法、高效離子色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、流動(dòng)注射分析法、電化學(xué)法、光譜分析法等[8-9]，上述方法往往存在樣品前處理過程復(fù)雜、分析時(shí)間長(zhǎng)、準(zhǔn)確度偏低等缺點(diǎn)。為了準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)食品中的甜味劑，做到有效合理利用人工合成甜味劑，以確保食品安全和人類健康，作者對(duì)樣品的前處理和上述甜味劑測(cè)定進(jìn)行了深入研究，建立了檢測(cè)5種甜味劑的HPCE法，旨在為HPCE同時(shí)檢測(cè)食品中多種甜味劑提供一定的參考依據(jù)。該方法樣品前處理簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)易、分離效率高、分析速度快、線性關(guān)系好、線性范圍寬、重現(xiàn)性好，定量測(cè)定5種食品中的上述甜味劑含量，結(jié)果令人滿意。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 P/ACETMMDQ毛細(xì)管電泳系統(tǒng)（Beckman Coulter，F(xiàn)ullerton，CA，USA），紫外-可見吸收檢測(cè)器，內(nèi)壁未涂層熔融石英毛細(xì)管（50 μm×75 cm，有效長(zhǎng)度60 cm），32Karat電泳分析軟件，均由河北永年銳灃色譜器件有限公司提供；FA/JA系列精密電子天平（精度：0.000 1 g），天津天馬衡基儀器有限公司制造；KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司制造；800型電動(dòng)離心機(jī)，金壇市杰瑞爾電器有限公司制造；DZF-6050B型真空干燥箱，上海齊欣科技儀器有限公司制造；0.22 μm水相混合纖維素酯膜，上海半島實(shí)業(yè)有限公司凈化器材廠制造。

1.1.2 試劑 紐甜、阿斯巴甜、甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜標(biāo)準(zhǔn)樣品（純度>99%），美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；乙腈（色譜純），江蘇漢邦科技有限公司產(chǎn)品；濃HCl（分析純），蚌埠市生原精細(xì)化工有限責(zé)任公司產(chǎn)品；三氯乙酸（分析純），濟(jì)南市榮盛化工有限公司產(chǎn)品；無(wú)水乙醇（分析純），安徽安特食品股份有限公司產(chǎn)品；二次蒸餾水，“好吃點(diǎn)”、“西梅”、“親嘴燒”、素牛味棒、草莓味酸奶，均購(gòu)買于本地超市。

1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

將標(biāo)準(zhǔn)樣品經(jīng)100℃減壓烘干4 h至恒質(zhì)量后，分別準(zhǔn)確稱取紐甜5.5 mg、阿斯巴甜5.1 mg、甜蜜素12.7 mg、糖精鈉 9.0 mg、安賽蜜40.3 mg于 10 mL容量瓶中，加適量二次蒸餾水完全溶解后再定容至刻度，混勻，得5種樣品的原標(biāo)準(zhǔn)混合溶液。取上述原標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋5倍、10倍、20倍、40倍、60倍，即得不同質(zhì)量濃度系列的5種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液；采用上述方法分別配制5種甜味劑的單一標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用待分析。

1.3 樣品處理

分別將固體食品“好吃點(diǎn)”、西梅、“親嘴燒”、素牛味棒等食品粉碎，稱取適量（準(zhǔn)確至0.000 1 g），分別置于25 mL的比色管中，加1 mL無(wú)水乙醇，再加15 mL二次蒸餾水，超聲振蕩1 h，靜置24 h，再超聲振蕩1 h，加水至刻度，4 000 r/min離心20 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，得濾液；取一定量的液體食品酸奶，采用3 mL 100 g/L的三氯乙酸除蛋白質(zhì)[10-11]，過濾，得濾液。待分析。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 電泳條件 電泳毛細(xì)管：熔融石英毛細(xì)管75 cm（60 cm 處檢測(cè)窗口）×50 μm；緩沖液：0.2 mol/L硼酸鹽（pH=8.29）；分離電壓+23kV，進(jìn)樣壓力 3.45 kPa，進(jìn)樣時(shí)間3.0 s，分離溫度25℃，UV-Vis檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)200 nm。每次電泳分析之前要依次運(yùn)行如下沖洗程序：0.1 mol/L NaOH溶液沖洗1 min，0.1 mol/L HCl溶液沖洗1 min，二次蒸餾水沖洗1 min，緩沖溶液沖洗2 min。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及樣品測(cè)定 分別取按1.2法配制的不同質(zhì)量濃度系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述選定電泳分離條件下進(jìn)樣測(cè)定分析，以峰面積（y）對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性回歸，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)際樣品經(jīng)前處理后，按同樣電泳條件進(jìn)行分析。按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中各甜味劑含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Origin 8.0軟件處理、統(tǒng)計(jì)、分析、作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 電泳條件的優(yōu)化

通過以下實(shí)驗(yàn)確定最佳電泳條件為：電泳緩沖溶液：0.2 mol/L 硼酸鹽（pH=8.29）；分離電壓+23 kV，UV-Vis檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)200 nm。文中未特別指明之處皆為此實(shí)驗(yàn)條件。實(shí)驗(yàn)步驟具體分析如下。

2.1.1 緩沖溶液pH值的選擇 以電滲流（EOF）為驅(qū)動(dòng)力的毛細(xì)管電泳法，其EOF對(duì)緩沖溶液的pH值十分敏感。因緩沖溶液pH值影響毛細(xì)管表面的ξ電勢(shì)，進(jìn)而影響EOF方向及大??；pH值也影響樣品中各組分分子表面電荷數(shù)量，從而影響組分遷移速度及分離效果；pH值改變影響組分電離程度，影響其與管壁表面作用，影響組分的遷移速度，最終影響分離度[12]。因此，pH值對(duì)分離效果影響較大。本實(shí)驗(yàn)中考察了硼酸鹽緩沖溶液pH值在7.34～10.00之間對(duì)組分遷移時(shí)間的影響，見圖1。結(jié)果表明：當(dāng)緩沖溶液pH=8.29時(shí)，分離效果最佳。

圖1 不同緩沖液pH值下5種甜味劑電泳圖Fig.1 Electrophoretograms of 5 kinds of artificial sweeteners at different pH values of buffer

2.1.2 分離電壓的選擇 在高效毛細(xì)管電泳中，分離電壓是分離的動(dòng)力，對(duì)分離度有較大影響。分離電壓決定電場(chǎng)強(qiáng)度，而電場(chǎng)強(qiáng)度影響EOF大小及帶電粒子遷移速率，從而決定組分遷移時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)在+14～+29 kV范圍內(nèi)考察了分離電壓對(duì)各組分遷移時(shí)間的影響，見圖2。可知：分離電壓越高，組分的遷移時(shí)間越短。當(dāng)分離電壓為+23 kV時(shí)，各組分均達(dá)到基線分離，且保留時(shí)間較短；當(dāng)分離電壓超過+23 kV時(shí)，雖各組分出峰時(shí)間較短，但分離度降低；當(dāng)分離電壓低于+23 kV時(shí)，分離度改變不明顯，但由于電壓較低造成的組分峰拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，不利于樣品的精確定量分析。故選擇+23 kV作為分離電壓。

圖2 不同電壓下5種甜味劑電泳圖Fig.2 Electrophoretograms of 5 kinds of artificial sweeteners in different voltages

2.1.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 采用紫外-可見吸收檢測(cè)器分別對(duì) 200、214、254、280 nm等 4個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行考察，得電泳圖。由圖3知：254 nm和280 nm時(shí)，各組分吸收值均較低，不宜作為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)；214nm時(shí)，雖安賽蜜對(duì)應(yīng)電泳峰較高，但紐甜、阿斯巴甜、甜蜜素、糖精鈉4組分電泳峰較低，不夠靈敏，亦不宜作為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。甜蜜素由于本身無(wú)共軛結(jié)構(gòu)，上述波長(zhǎng)下紫外吸收均較弱，靈敏度較低。綜合考慮，選擇200 nm作為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖3 不同波長(zhǎng)下5種甜味劑電泳圖Fig.3 Electrophoretograms of 5 kinds of artificial sweeteners at different wavelengths

2.2 5種甜味劑的定性分析

分別取1.2中5種標(biāo)準(zhǔn)樣品單一溶液和其混合溶液，在最佳電泳條件下測(cè)定，得電泳圖。從圖4可以看出，此5種甜味劑在11 min內(nèi)能有效分離。出峰順序依次為：紐甜、阿斯巴甜、甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜。

圖4 最佳條件下5種甜味劑電泳圖Fig.4 Electrophoretograms of 5 kinds of artificial sweeteners under optimal conditions

2.3 定量分析方法的建立

2.3.1 線性范圍、檢出限和定量限 根據(jù)各組分的峰面積（y）對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度（x）的線性回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍；以各組分的信噪比S/N=3時(shí)相應(yīng)質(zhì)量濃度確定為最低檢出限（LOD）；以各組分的信噪比S/N=10時(shí)相應(yīng)質(zhì)量濃度確定為最低定量限（LOQ），所得定量分析參數(shù)見表1。結(jié)果表明：5種組分在較寬范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，能夠滿足定量分析的要求。

表1 定量分析參數(shù)（LOD，S/N=3）Table 1 Parameters of HPLC quantitative analysis （LOD，S/N=3）

2.3.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 采用1.2原混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次，求出相應(yīng)電泳峰面積及均值，計(jì)算出相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），所得結(jié)果見表 2?？芍?種甜味劑的RSD在3.81%～6.40%之間，精密度符合方法學(xué)要求，能夠用于食品中上述甜味劑的定量分析。

2.3.3 加標(biāo)回收率 準(zhǔn)確稱量一定質(zhì)量的西梅，按照1.3樣品處理方法處理，然后在測(cè)定線性范圍內(nèi)加入適量的5種甜味劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)樣檢測(cè)。連續(xù)分析5次，5種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果見表3。結(jié)果表明：5種甜味劑的加標(biāo)回收率在96.29%～102.31%，回收率適中，可用于食品中甜味劑的檢測(cè)。

表2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=5）Table 2 Results of repeated experiment（n=5）

表3 加標(biāo)回收率結(jié)果（n=5）Table 3 Results of spiked recoveries（n=5）

2.4 5種樣品中甜味劑含量的測(cè)定

分別對(duì)1.3所得5種樣品溶液中的甜味劑進(jìn)行定量分析檢測(cè)，每種樣品平行測(cè)定6次，所得電泳圖見圖5。根據(jù)所測(cè)峰面積及線性回歸方程計(jì)算樣品中甜味劑含量，其結(jié)果見表4。

3 結(jié)語(yǔ)

建立了同時(shí)測(cè)定食品中5種甜味劑的高效毛細(xì)管電泳法，該方法樣品前處理簡(jiǎn)單、靈敏度高、準(zhǔn)確可靠、精密度高，所得定量分析參數(shù)均能滿足測(cè)定要求。通過實(shí)驗(yàn)分析，5種甜味劑的加標(biāo)回收率為96.29%～102.31%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.81%～6.40%，表明此方法能夠滿足食品中多種甜味劑的同時(shí)檢測(cè)，操作簡(jiǎn)捷易行。

圖5 5種甜味劑加標(biāo)回收率電泳圖Fig.5 Electrophoretograms of 5 kinds of artificial sweeteners for spiked recoveries

表4 5種食品中甜味劑測(cè)定結(jié)果（n=6）Table 4 Determination results of sweeteners in 5 samples（n=6）

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