姚傳山?馬磊?趙旭林?賀利民

【摘要】 目的 探討CD34及血管內皮生長因子（VEGF）在非小細胞肺癌（NSCLC）中的表達、關系及臨床意義。方法 應用免疫組織化學方法檢32例肺癌組織和25例癌旁組織中VEGF表達及MVD值， 觀察二者數值變化與組織學類型、分化程度和淋巴結有無轉移的關系。結果 與瘤旁組織比較， 瘤組織中MVD值及VEGF表達陽性率高（P<0.05）；VEGF表達陽性率及MVD值的升高大致與臨床Ⅰ～Ⅳ期的升高呈正相關；與無淋巴結轉移患者比較， 有淋巴結轉移患者瘤組織中MVD值及VEGF表達陽性率差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與組織類型及分化程度病理特征因素之間的瘤組織的MVD值與VEGF表達陽性率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結論 NSCLC組織中CD34和VEGF常常為高表達，二者具有正相關性， 與腫瘤的TNM分期及有無淋巴結轉移有關。

【關鍵詞】 CD34；血管內皮生長因子；非小細胞肺癌；表達

肺癌是目前常見惡性腫瘤之一， 其病死率居惡性腫瘤首位[1]， 其分為非小細胞肺癌及小細胞肺癌， 其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer， NSCLC）大約占肺癌類型的80%。諸多研究已經證實血管新生是促進腫瘤生長的關鍵所在， 新生的血管不僅可以提供瘤體豐富的血液供應， 而且為腫瘤的血行轉移提供了良好的條件[2]。而且新生的血管基底膜呈節(jié)段性分布， 對腫瘤細胞具有高度親和性。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）及CD34是調節(jié)腫瘤血管形成的關鍵因子及血管標記物[3-5]， 但二者的關系目前還不明確。本研究應用免疫組織化學法檢測NSCLC腫癌組織的VEGF、CD34的表達， 探討二者的關系及其臨床意義?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 收集南陽市第一人民醫(yī)院2011年1月～ 2012年6月行手術切除的非小細胞肺癌患者32例， 其中男18例， 女14例， 年齡32～78歲， 平均年齡（58.7±6.9）歲， 所有患者術前均未接受放、化療及生物免疫治療。肺癌的組織學分類為：鱗癌11例， 腺癌15例， 細支氣管肺泡癌6例。分化程度為：高分化8例， 中分化10例， 低分化14例。有淋巴結轉移19例， 無淋巴結轉移13例。TNM分期：Ⅰ期7例， Ⅱ期13例， Ⅲ～Ⅳ期12例。選擇同期25例癌旁組織（距癌組織5 cm以上）作為對照。所有標本均用10%中性甲醛溶液固定， 石蠟包埋， 切片厚3 μm。

1. 2 主要試劑 兔抗人VEGF及山羊抗兔Ig-HRP均由美國SANTA CRUZ公司生產， 單克隆抗體即用型CD34與即用型DAB顯色液由北京中山公司生產； CDEF試劑盒為8ESO公司產品。

1. 3 方法

1. 3. 1 免疫組織化學法檢測VEGF

1. 3. 1. 1 按照免疫組織化學操作步驟依次進行脫蠟、抗原修復（高壓修復）、加一抗（濕盒37℃放置1 h或4℃放置24 h）， 加二抗（濕盒37℃放置1 h）、DAB顯色、顯微鏡觀察計數、拍片分析。

1. 3. 1. 2 結果判定 胞漿染成棕黃或棕褐色為陽性細胞， 陰性細胞不染色。陽性細胞表達結果判斷參照 Senger方法[6]， 著色細胞數<10%為（-）， 11% ～30%為（+），31% ～70%為（++）， >70%為（+++）。

1. 3. 2 CD34免疫組化染色

1. 3. 2. 1 參照文獻介紹的方法， 采用6 M抗原修復CDEF免疫組織化學染色方法， 進行CD34標記。對照染色：每次用已知CD34陽性標本切片作為陽性對照， 用PBS代替一抗或生物素標記的橋抗 （二抗） 作為陰性對照。

1. 3. 2. 2 結果判定、微血管計數 微血管計數方法（MVD計數法）參照Weidner校正方法。在低倍鏡下（×100）尋找組織內微血管最多的區(qū)域染色， 即所謂的“熱點”， 之后換用高倍鏡（×400）， 在高倍鏡下計數小靜脈和毛細血管的數目， 排除腫瘤附近的的正常肺實質內的微血管以及有平滑肌壁及管腔直徑>8個紅細胞直徑的血管。所有標本由經驗豐富的病理科醫(yī)生閱讀3次取平均值。

1. 4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS19.0統(tǒng)計分析軟件進行處理。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗；計數資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

與瘤旁組織比較， 瘤組織中微血管數目明顯增多， VEGF表達陽性率明顯提高（t值、χ2值分別為6.791， 16.116， P<0.05）；與無淋巴結轉移患者比較， 有淋巴結轉移患者瘤組織中MVD值及VEGF表達陽性率差異有統(tǒng)計學意義（t值、χ2值分別為3.457， 5.203， P<0.01）；VEGF表達陽性率及MVD值的升高大致與臨床Ⅰ～Ⅳ期的升高呈正相關；與組織類型及分化程度病理特征因素之間的瘤組織的MVD值與VEGF表達陽性率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

3 討論

腫瘤患者的早期診斷和治療是提高5年生存率的關鍵措施，如何實現(xiàn)對肺癌早期診斷并準確估計其轉移能力一直是臨床研究的熱點問題。

研究證實惡性腫瘤的生長、局部浸潤及轉移等與新生血管關系密切。新生血管是指在某些因素的刺激作用下，由內皮細胞分化而成的一些新生血管，其對于實體腫瘤的生長、發(fā)展非常重要，是影響腫瘤生物學行為和轉移復發(fā)的重要因素[2， 3]。新生的腫瘤血管不僅是癌細胞增殖的內部條件，也是癌細胞浸潤和血行轉移首要途徑。腫瘤在生長過程中需要新生血管不斷生成才能滿足其擴增和營養(yǎng)代謝的需要，當腫瘤形成自身的血管系統(tǒng)后，才可以迅速生長，同時瘤細胞進入血管或淋巴管發(fā)生轉移。

VEGF是一種多肽類細胞因子，與腫瘤血管生成密切相關。研究顯示VEGF在腫瘤組織內， 如肝癌、乳腺癌、肺癌等腫瘤組織內分泌增多， 并且與新生血管的生成有關。主要作用機制為：①促進血管形成的功能：促進內皮細胞分裂、增殖， 并且誘導新生血管生成；②增加血管通透性：VEGF可以迅速增加血管通透性， 作用短暫而強大， 使血漿蛋白包括纖維蛋白外滲， 形成纖維素網絡， 為毛細血管延伸生長提供良好基質。③增加組織因子的產生：VEGF通過改變內皮細胞基因表達來誘導內皮細胞表達血漿纖溶酶原激活劑及血漿纖溶酶原激活物抑制劑， 有利于血管形成。在眾多誘導血管生成的因子中，VEGF被認為是最重要的血管生成因子。VEGF對于淋巴管的新生也有著非常重要的作用， 尤其與淋巴侵犯和不良的預后結局有關。本研究結果顯示， 瘤組織中VEGF表達陽性率明顯高于瘤旁組織， 而且瘤組織中VEGF表達陽性率與TNM分期及有否淋巴結轉移密切相關， 表明VEGF表達與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展及淋巴結轉移有關[2， 3， 6]。腫瘤組織的微血管密度（MVD）不僅可定量地反映腫瘤血管生長情況， 還能預示腫瘤生長、轉移和復發(fā)趨勢[4， 5]。CD34是血管內皮標記物之一， 應用廣泛， 被認為是重復性好、穩(wěn)定性高、較成熟的血管內皮標記物， 作為常規(guī)指標應用于多種惡性腫瘤的免疫組化檢測。程繼榮等[5]研究證實CD34可作為最敏感肺癌微血管標記物之一。本研究還顯示瘤組織中VEGF表達陽性率與微血管數目MVD值呈正相關， 而且與VEGF一樣， 微血管數目MVD值與TNM分期及有否淋巴結轉移差有關， 上述結果表明VEGF表達與CD34存在相關性， VEGF表達越高， 誘導腫瘤血管生成越多， 血管內皮細胞中CD34表達也越多， 從而也間接證實VEGF在腫瘤血管形成中的重要作用。這為臨床腫瘤的抗血管生成治療提供依據[2]?？寡苌芍委熎浠驹硎峭ㄟ^切斷腫瘤賴以生長和轉移的營養(yǎng)來源及遷移通道，間接發(fā)揮治療作用。目前抗血管生成治療已經從實驗室走向臨床，為控制腫瘤的發(fā)展、預防腫瘤的轉移和復發(fā)開辟了廣闊的前景。

綜上所述， NSCLC組織中存在CD34和VEGF過度表達， 二者均與腫瘤TNM分期及有否淋巴結轉移密切相關。

參考文獻

[1] Pollock RE， Doroshow JH， Khayat D. UICC臨床腫瘤學手冊.孫燕，湯釗猷，譯. 第8版.北京：人民衛(wèi)生出版社， 2008：302.

[2] 王剛， 代小菊. 血管內皮生長因子與腫瘤的抗血管生成治療. 中國醫(yī)藥， 2006， 1（9）：574-576.

[3] Socinski MA. Multitargeted receptor tyrosine kinase inhibition： an antiangiogenic strategy in non-small cell lung cancer. Cancer Treat Rev， 2011， 37（8）：611-617.

[4] 汪國文，王祖義，劉學剛， 等. CD31與CD34顯示非小細胞肺癌微血管密度的對比分析.蚌埠醫(yī)學院學報， 2009， 34（3）：185-187.

[5] 程繼榮， 徐虓， 王淑琴. 肺癌組織CD31、CD34及CD105標記的微血管密度的臨床意義.中國癌癥雜志， 2010， 20（8）：638-640.

[6] Luo H， Chen Z， Jin H， et al. Cyclooxygenase-2 up-regulates vascular endothelial growth factor via a protein kinase C pathway in non-small cell lung cancer. J Exp Clin Cancer Res， 2011， doi：10.1186/1756-9966-30-6.

[收稿日期：2014-09-12]

VEGF是一種多肽類細胞因子，與腫瘤血管生成密切相關。研究顯示VEGF在腫瘤組織內， 如肝癌、乳腺癌、肺癌等腫瘤組織內分泌增多， 并且與新生血管的生成有關。主要作用機制為：①促進血管形成的功能：促進內皮細胞分裂、增殖， 并且誘導新生血管生成；②增加血管通透性：VEGF可以迅速增加血管通透性， 作用短暫而強大， 使血漿蛋白包括纖維蛋白外滲， 形成纖維素網絡， 為毛細血管延伸生長提供良好基質。③增加組織因子的產生：VEGF通過改變內皮細胞基因表達來誘導內皮細胞表達血漿纖溶酶原激活劑及血漿纖溶酶原激活物抑制劑， 有利于血管形成。在眾多誘導血管生成的因子中，VEGF被認為是最重要的血管生成因子。VEGF對于淋巴管的新生也有著非常重要的作用， 尤其與淋巴侵犯和不良的預后結局有關。本研究結果顯示， 瘤組織中VEGF表達陽性率明顯高于瘤旁組織， 而且瘤組織中VEGF表達陽性率與TNM分期及有否淋巴結轉移密切相關， 表明VEGF表達與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展及淋巴結轉移有關[2， 3， 6]。腫瘤組織的微血管密度（MVD）不僅可定量地反映腫瘤血管生長情況， 還能預示腫瘤生長、轉移和復發(fā)趨勢[4， 5]。CD34是血管內皮標記物之一， 應用廣泛， 被認為是重復性好、穩(wěn)定性高、較成熟的血管內皮標記物， 作為常規(guī)指標應用于多種惡性腫瘤的免疫組化檢測。程繼榮等[5]研究證實CD34可作為最敏感肺癌微血管標記物之一。本研究還顯示瘤組織中VEGF表達陽性率與微血管數目MVD值呈正相關， 而且與VEGF一樣， 微血管數目MVD值與TNM分期及有否淋巴結轉移差有關， 上述結果表明VEGF表達與CD34存在相關性， VEGF表達越高， 誘導腫瘤血管生成越多， 血管內皮細胞中CD34表達也越多， 從而也間接證實VEGF在腫瘤血管形成中的重要作用。這為臨床腫瘤的抗血管生成治療提供依據[2]?？寡苌芍委熎浠驹硎峭ㄟ^切斷腫瘤賴以生長和轉移的營養(yǎng)來源及遷移通道，間接發(fā)揮治療作用。目前抗血管生成治療已經從實驗室走向臨床，為控制腫瘤的發(fā)展、預防腫瘤的轉移和復發(fā)開辟了廣闊的前景。

綜上所述， NSCLC組織中存在CD34和VEGF過度表達， 二者均與腫瘤TNM分期及有否淋巴結轉移密切相關。

參考文獻

[1] Pollock RE， Doroshow JH， Khayat D. UICC臨床腫瘤學手冊.孫燕，湯釗猷，譯. 第8版.北京：人民衛(wèi)生出版社， 2008：302.

[2] 王剛， 代小菊. 血管內皮生長因子與腫瘤的抗血管生成治療. 中國醫(yī)藥， 2006， 1（9）：574-576.

[3] Socinski MA. Multitargeted receptor tyrosine kinase inhibition： an antiangiogenic strategy in non-small cell lung cancer. Cancer Treat Rev， 2011， 37（8）：611-617.

[4] 汪國文，王祖義，劉學剛， 等. CD31與CD34顯示非小細胞肺癌微血管密度的對比分析.蚌埠醫(yī)學院學報， 2009， 34（3）：185-187.

[5] 程繼榮， 徐虓， 王淑琴. 肺癌組織CD31、CD34及CD105標記的微血管密度的臨床意義.中國癌癥雜志， 2010， 20（8）：638-640.

[6] Luo H， Chen Z， Jin H， et al. Cyclooxygenase-2 up-regulates vascular endothelial growth factor via a protein kinase C pathway in non-small cell lung cancer. J Exp Clin Cancer Res， 2011， doi：10.1186/1756-9966-30-6.

[收稿日期：2014-09-12]

VEGF是一種多肽類細胞因子，與腫瘤血管生成密切相關。研究顯示VEGF在腫瘤組織內， 如肝癌、乳腺癌、肺癌等腫瘤組織內分泌增多， 并且與新生血管的生成有關。主要作用機制為：①促進血管形成的功能：促進內皮細胞分裂、增殖， 并且誘導新生血管生成；②增加血管通透性：VEGF可以迅速增加血管通透性， 作用短暫而強大， 使血漿蛋白包括纖維蛋白外滲， 形成纖維素網絡， 為毛細血管延伸生長提供良好基質。③增加組織因子的產生：VEGF通過改變內皮細胞基因表達來誘導內皮細胞表達血漿纖溶酶原激活劑及血漿纖溶酶原激活物抑制劑， 有利于血管形成。在眾多誘導血管生成的因子中，VEGF被認為是最重要的血管生成因子。VEGF對于淋巴管的新生也有著非常重要的作用， 尤其與淋巴侵犯和不良的預后結局有關。本研究結果顯示， 瘤組織中VEGF表達陽性率明顯高于瘤旁組織， 而且瘤組織中VEGF表達陽性率與TNM分期及有否淋巴結轉移密切相關， 表明VEGF表達與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展及淋巴結轉移有關[2， 3， 6]。腫瘤組織的微血管密度（MVD）不僅可定量地反映腫瘤血管生長情況， 還能預示腫瘤生長、轉移和復發(fā)趨勢[4， 5]。CD34是血管內皮標記物之一， 應用廣泛， 被認為是重復性好、穩(wěn)定性高、較成熟的血管內皮標記物， 作為常規(guī)指標應用于多種惡性腫瘤的免疫組化檢測。程繼榮等[5]研究證實CD34可作為最敏感肺癌微血管標記物之一。本研究還顯示瘤組織中VEGF表達陽性率與微血管數目MVD值呈正相關， 而且與VEGF一樣， 微血管數目MVD值與TNM分期及有否淋巴結轉移差有關， 上述結果表明VEGF表達與CD34存在相關性， VEGF表達越高， 誘導腫瘤血管生成越多， 血管內皮細胞中CD34表達也越多， 從而也間接證實VEGF在腫瘤血管形成中的重要作用。這為臨床腫瘤的抗血管生成治療提供依據[2]?？寡苌芍委熎浠驹硎峭ㄟ^切斷腫瘤賴以生長和轉移的營養(yǎng)來源及遷移通道，間接發(fā)揮治療作用。目前抗血管生成治療已經從實驗室走向臨床，為控制腫瘤的發(fā)展、預防腫瘤的轉移和復發(fā)開辟了廣闊的前景。

綜上所述， NSCLC組織中存在CD34和VEGF過度表達， 二者均與腫瘤TNM分期及有否淋巴結轉移密切相關。

參考文獻

[1] Pollock RE， Doroshow JH， Khayat D. UICC臨床腫瘤學手冊.孫燕，湯釗猷，譯. 第8版.北京：人民衛(wèi)生出版社， 2008：302.

[2] 王剛， 代小菊. 血管內皮生長因子與腫瘤的抗血管生成治療. 中國醫(yī)藥， 2006， 1（9）：574-576.

[3] Socinski MA. Multitargeted receptor tyrosine kinase inhibition： an antiangiogenic strategy in non-small cell lung cancer. Cancer Treat Rev， 2011， 37（8）：611-617.

[4] 汪國文，王祖義，劉學剛， 等. CD31與CD34顯示非小細胞肺癌微血管密度的對比分析.蚌埠醫(yī)學院學報， 2009， 34（3）：185-187.

[5] 程繼榮， 徐虓， 王淑琴. 肺癌組織CD31、CD34及CD105標記的微血管密度的臨床意義.中國癌癥雜志， 2010， 20（8）：638-640.

[6] Luo H， Chen Z， Jin H， et al. Cyclooxygenase-2 up-regulates vascular endothelial growth factor via a protein kinase C pathway in non-small cell lung cancer. J Exp Clin Cancer Res， 2011， doi：10.1186/1756-9966-30-6.

[收稿日期：2014-09-12]