曹曉林， 鞏佳第， 陳銘學(xué)， 于莎莎， 卞英芳， 曹趙云

（中國水稻研究所，農(nóng)業(yè)部稻米及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，農(nóng)業(yè)部稻米產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州310006）

鳥槍法蛋白質(zhì)組學(xué)是繼傳統(tǒng)的凝膠電泳-質(zhì)譜技術(shù)之后的另一種新型蛋白質(zhì)分析策略。近年來，隨著色譜-質(zhì)譜技術(shù)和生物信息學(xué)的迅速發(fā)展［1-3］，以及各種蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的日益完善，鳥槍法蛋白質(zhì)組學(xué)成為分析復(fù)雜蛋白質(zhì)組的有力工具［4，5］，并已成功地用于水稻等重要作物的器官發(fā)育調(diào)控機(jī)理、逆境脅迫生理和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全等熱點(diǎn)研究領(lǐng)域［6，7］。然而，鳥槍法蛋白質(zhì)組學(xué)中，蛋白質(zhì)樣品制備方法仍存在亟待解決的問題，突出表現(xiàn)在蛋白質(zhì)離液劑選擇和對其去除的矛盾上。

蛋白質(zhì)組的準(zhǔn)確鑒定高度依賴于蛋白質(zhì)的裂解、變性程度等［8］。雖然十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）裂解法是當(dāng)前使用最為廣泛和有效的蛋白質(zhì)（尤其是疏水膜蛋白質(zhì)）裂解技術(shù)［9，10］，但蛋白質(zhì)裂解液中殘留的SDS 會(huì)顯著降低酶解效率、干擾肽段的色譜分離并對目標(biāo)物離子化過程產(chǎn)生強(qiáng)烈的離子抑制作用［11，12］。由此可見，研究建立高效的SDS 凈化方法是解決上述矛盾的關(guān)鍵。目前針對SDS 的凈化主要依賴于傳統(tǒng)的丙酮沉淀法［13］、超濾輔助樣品制備（filter aided sample preparation，F(xiàn)ASP）法［9］以及各種色譜法等。盡管這些技術(shù)均有較好的去除SDS 效果，但通常會(huì)引起疏水性蛋白質(zhì)的損失［9，14］，且存在步驟繁瑣、操作耗時(shí)、分析通量低等問題。親和去垢小柱是近年來推出的一種新型凈化小柱，利用內(nèi)部樹脂填料的疏水性空腔可與離液劑形成配合物的特性達(dá)到將其去除的目的［15］。該小柱由于對SDS 吸附作用強(qiáng)，引起目標(biāo)蛋白質(zhì)損失小等優(yōu)點(diǎn)已日益引起人們的關(guān)注，然而，目前僅在針對動(dòng)物和微生物蛋白質(zhì)處理中有少量報(bào)道［16］，尚未見其在植物樣品中的應(yīng)用。

本實(shí)驗(yàn)將該新型親和去垢小柱用于水稻蛋白質(zhì)樣品的凈化?？疾炝藗鹘y(tǒng)的FASP 法、丙酮沉淀法和新型親和去垢小柱法對SDS 的去除效果，比較了上述3 種凈化技術(shù)對水稻葉片蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果（蛋白質(zhì)數(shù)目、相對分子質(zhì)量和等電點(diǎn)分布）的影響，最終建立了以親和去垢小柱凈化，納升液相色譜-線性離子阱／靜電場軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用的水稻葉片蛋白質(zhì)分析方法，以期為水稻蛋白質(zhì)樣品的凈化及開展相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供重要技術(shù)參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

Easy nLC 1000 納升級液相色譜儀、LTQ-Orbitrap 組合高分辨質(zhì)譜儀（附納噴霧離子源）、Biofuge Primo R 型臺(tái)式冷凍離心機(jī)（美國ThermoFisher 公司）。冷 凍 干 燥 機(jī) FreeZone 2.5 Plus （美 國LABCONCO 公司）；分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）；PHS-3C 精密pH 計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；電熱恒溫振蕩水槽DK2-28（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 試劑與材料

Tris-HCl、SDS、碘 代 乙酰 胺（iodoacetamide，IAA）、PBS 緩沖液（phosphate buffer saline）、胰蛋白酶（trypsin）和蛋白酶抑制劑均購于Sigma 公司；碳酸氫銨購于Acros Organics 公司；二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）購于Promega 公司；乙腈、甲醇購于德國Merck 公司；Tris 飽和酚、SDS 殘留檢測試劑盒購于Sangon 公司；以上試劑均為分析純或色譜純。實(shí)驗(yàn)室用水為Milli-Q 高純水（電阻率為18.2 MΩ·cm）；親和去垢小柱（pierce affinity detergent removal spin columns）購自Thermo 公司；C18-SD 除鹽小柱購自Agilent 公司。水稻品種鎮(zhèn)稻11 號(hào)由中國水稻研究提供，在中國水稻研究所網(wǎng)室進(jìn)行常規(guī)土培，采集完熟期水稻葉片，用液氮速凍并在-80 ℃冰箱中保存，待用。

1.3 樣品的制備

1.3.1 葉片總蛋白質(zhì)的提取

葉片總蛋白質(zhì)提取參考Sheoran 等［17］報(bào)道的酚提取法進(jìn)行。稱取3 g 經(jīng)液氮研磨后的水稻葉片樣品，加入20 mL 提取緩沖液（含100 mmol／L KCl、0.7 mol／L 蔗 糖、50 mmol／L Tris-HCl、5 mmol／L EDTA、10 μL 蛋白酶抑制劑），振蕩混勻，加入1 mol／L DTT 200 μL，于4 ℃振蕩30 min；加入等體積的Tris 飽和酚，混勻后于4 ℃、6 000 g 條件下離心30 min；取上層酚相，加入等體積提取緩沖液，重復(fù)上述離心步驟一次；最后取出上層酚相，加入3 倍體積的預(yù)冷甲醇溶液（含0.1 mol／L 乙酸銨），于-20℃靜置過夜；再按上述條件離心，棄上清液；分別用甲醇和丙酮清洗沉淀兩次，冷凍干燥。

1.3.2 蛋白質(zhì)的裂解

參照Sheoran［17］方法，略有改進(jìn)。取上述蛋白質(zhì)樣品1 mg，加入450 μL 40 g／L SDS 溶液（含100 mmol／L Tris-HCl，pH 8.0），95 ℃中加熱3 min，再加入1 mol／L DTT 至終濃度為0.1 mol／L，置于37℃水浴中加熱2.5 h，取出，待凈化。

1.3.3 蛋白質(zhì)的凈化及酶解

1.3.3.1 親和去垢小柱法

取100 μL蛋白質(zhì)裂解溶液，加100 μL水混勻。將親和去垢小柱置于2 mL 離心管中，于1 500 g 離心1 min，以除去原有的儲(chǔ)存溶液；向親和去垢小柱內(nèi)加入400 μL平衡緩沖溶液（PBS 溶液），于1 500 g 離心1 min，棄流出液，重復(fù)一次；將上述稀釋后的裂解液移入親和去垢小柱內(nèi)，常溫放置2 min 后，于1 500 g 離心2 min，收集流出液；取出少許，待測SDS 殘留量；其余部分用10 mmol／L NH4HCO3稀釋至500 μL，并加入胰蛋白酶4 μg，于37 ℃水浴酶解16 h；酶解液分別經(jīng)C18-SD 脫鹽和冷凍干燥，最后用100 μL 0.1%（v／v）甲酸溶液溶解，待上機(jī)。

1.3.3.2 FASP 法

參考Wis＇niewski 等［18］和Manza 等［19］的方法:取裂解還原后的蛋白質(zhì)溶液100 μL，用8 mol／L 的尿素（以100 mmol／L Tris-HCl 配制，pH 8.5）稀釋至SDS 質(zhì)量濃度為1 g／L，備用；用10 kDa 超濾離心管超濾離心（4 ℃、6 000 g）30 min 經(jīng)稀釋后的蛋白質(zhì)溶液，每次約4 mL；再加入2 mL 8 mol／L 尿素（以100 mmol／L Tris-HCl 配制，pH 8.0），相同條件下超濾離心，重復(fù)3 次；合并流出液，測SDS 殘留量；最后將尿素置換后酶解，后續(xù)操作同1.3.3.1 節(jié)。

1.3.3.3 丙酮沉淀法

參考Lin 等［13］方法:取裂解還原后的蛋白質(zhì)溶液100 μL，加入600 μL預(yù)冷丙酮，渦旋振蕩，置于-20℃冰箱中過夜；于4 ℃、10 000 g 條件下離心40 min；取出上清液，將離心管開口倒置于微塵紙上，至殘余液體流出；再加入1 mL 冷丙酮，渦旋振蕩1 min，重復(fù)上述步驟；合并兩次上清液用于測定SDS 的殘留量；樣品經(jīng)低溫干燥、酶解過夜。將酶解后的溶液加入到10 kDa 超濾管中，于室溫、6 000 g 離心30 min；再加入200 μL 50 mmol／L 碳酸氫銨，于室溫、6 000 g 離心30 min；后續(xù)操作同1.3.3.1 節(jié)。

1.3.4 SDS 的殘留定量

對3 種方法凈化后酶解前的流出液進(jìn)行SDS的殘留定量，參照SDS 殘留試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 儀器條件

色譜分析柱為Acclaim Pep Map RSLC（C18，15 cm×50 μm，2 μm）；預(yù)柱為Acclaim Pep Map 100（C18，2 cm×75 μm，3 μm）。柱溫30 ℃；流動(dòng)相A為0.1%（v／v）甲酸，B 為乙腈。梯度洗脫程序:0 ～120 min，0% B ～65% B；120 ～140 min，65% B ～95%B；140 ～160 min，95% B。流速為300 nL／min，進(jìn)樣量為2 μL。

設(shè)置電噴霧電壓為2 kV，離子傳輸毛細(xì)管的溫度為200 ℃。以數(shù)據(jù)依賴模式（data-dependent acquisition mode）進(jìn)行MS／MS 圖譜采集。一級質(zhì)譜采用Orbitrap 采集，掃描范圍為m／z 400 ～1 800，分辨率設(shè)為60 000；對全掃描中豐度最高的10 個(gè)離子峰用LTQ 進(jìn)行二級碎片采集，裂解模式為CID（collision induced dissociation），歸一化碰撞能量（normalized collision energy）為35%，離子活化時(shí)間（activation time）為30 ms。動(dòng)態(tài)排除（dynamic exclusion）設(shè)置:重復(fù)次數(shù)（repeat count）為2，重復(fù)間隔時(shí)間（repeat duration）為30 s，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間（exclusion duration）為90 s。

1.5 數(shù)據(jù)采集及處理

采用Xcalibur 軟件（Version 2.07，Thermo 公司）進(jìn)行系統(tǒng)控制和數(shù)據(jù)收集。質(zhì)譜采集數(shù)據(jù)在水稻蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Oryza_sativa Uniprot. fasta）中進(jìn)行檢索，數(shù) 據(jù)庫 來 源 于http:／／www. ncbi. nlm. nih.gov／protein／term ＝Oryza ＋sativa；數(shù)據(jù)庫檢索軟件為SEQUEST；所有肽段設(shè)置胰蛋白酶全酶切，最高允許兩個(gè)漏切位點(diǎn)；設(shè)定半胱氨酸殘基C 端為固定修飾＋57 Da，Met（M）為動(dòng)態(tài)修飾＋15.995 Da；前體離子的質(zhì)量容忍度設(shè)置為10 ppm，碎片離子的質(zhì)量容忍度設(shè)置為1 Da。假陽性率控制在1% 以內(nèi)，以此獲取更為可靠的鑒定結(jié)果。采用Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同凈化方法的SDS 去除效率及對蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果的影響

水稻葉片蛋白質(zhì)經(jīng)提取、裂解后，分別按FASP法、親和去垢小柱法和丙酮沉淀法進(jìn)行凈化及隨后的蛋白質(zhì)鑒定，實(shí)驗(yàn)分別考察了其SDS 去除效率以及對蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果的影響。結(jié)果表明，F(xiàn)ASP 法、親和去垢小柱法和丙酮沉淀法均有較好的SDS 去除效果，各自對應(yīng)的SDS 去除效率分別達(dá)98.7%、95.9%和97.3% （n ＝3）。三者鑒定得到蛋白質(zhì)數(shù)目為196、563 和306 種，其中親和去垢小柱法鑒定到的蛋白質(zhì)數(shù)目最多，分別是FASP 法和丙酮沉淀法的2.8 和1.8 倍。說明FASP 法、丙酮沉淀法在裂解液凈化過程中均造成明顯的蛋白質(zhì)損失，最終導(dǎo)致各自檢測到的蛋白質(zhì)數(shù)目減少。其主要原因可能是前者所采用的超濾膜對一些蛋白質(zhì)（尤其是膜蛋白質(zhì)）具有較強(qiáng)的吸附作用［20，21］，而丙酮沉淀法的損失主要與蛋白質(zhì)沉淀不完全有關(guān)［22］。對于親和去垢小柱法而言，除鑒定蛋白質(zhì)數(shù)目多以外，還具有過程簡單、操作步驟少和高通量等技術(shù)優(yōu)勢。

任取各自方法的一次蛋白質(zhì)分析結(jié)果，研究了鑒定蛋白質(zhì)種類上的互補(bǔ)性（見圖1）。3 種方法共鑒定出807 種非冗余蛋白質(zhì)，其中親和去垢小柱法可鑒定出565 種，占總鑒定蛋白質(zhì)種類的70% 以上；而FASP 法和丙酮沉淀法則分別鑒定出92 和124 種蛋白質(zhì)，僅約占鑒定總數(shù)的11.4%和15.4%，另外的26 種由它們共同鑒定得到，約占總數(shù)的3.2%?？梢姡M管3 種方法鑒定的蛋白質(zhì)存在一定的互補(bǔ)性，但親和去垢小柱法在鑒定蛋白質(zhì)種類上占絕對優(yōu)勢。

圖1 FASP 法、親和去垢小柱法和丙酮沉淀法在鑒定蛋白質(zhì)種類上的互補(bǔ)性Fig.1 Complementary analysis of identified proteins by filter aided sample preparation （FASP），detergent removal spin column （DRSC）and acetone precipitation methods

2.2 不同凈化方法所鑒定的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量及等電點(diǎn)的分布

在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，某個(gè)特定等電點(diǎn)（pI）或相對分子質(zhì)量（MW）范圍的蛋白質(zhì)通常更受關(guān)注［13］。為此，本文對FASP 法、親和去垢小柱法和丙酮沉淀法各自鑒定到的蛋白質(zhì)按MW和pI 進(jìn)行分析比較，以反映這3 種凈化方法對不同MW和pI蛋白質(zhì)的偏好性。

圖2 比較了3 種凈化方法所鑒定到蛋白質(zhì)在不同pI 值區(qū)間的數(shù)目?？梢钥闯?，親和去垢小柱法在不同pI 區(qū)間所鑒定到的蛋白質(zhì)均多于FASP 法和丙酮沉淀法，但3 種方法所鑒定的蛋白質(zhì)占各自鑒定蛋白質(zhì)數(shù)目的比例卻基本相同。在pI 6 ～9 之間，3種方法對應(yīng)的蛋白質(zhì)數(shù)目分別為91、257、135，占各自鑒定蛋白質(zhì)總數(shù)目的45% 左右；類似地，pI 3 ～6和pI≥9 時(shí)，3 種方法鑒定的數(shù)目均分別占各自鑒定總數(shù)目的35% 和18% 左右。由此說明3 種方法對不同pI 值的蛋白質(zhì)均沒有明顯的選擇性。

圖2 3 種凈化方法鑒定到的蛋白質(zhì)在不同等電點(diǎn)區(qū)間的分布Fig.2 Distribution of the identified proteins in different intervals of pI by three different purification methods

圖3 3 種凈化方法鑒定到的蛋白質(zhì)在不同相對分子質(zhì)量區(qū)間的分布Fig.3 Distribution of the identified proteins in different intervals of relative molecular masses by three different purification methods

圖3 表明了3 種凈化方法鑒定到的蛋白質(zhì)在不同MW區(qū)間的分布情況。可以看出，其結(jié)果與上述pI 值分布類似，即3 種凈化方法所鑒定蛋白質(zhì)占各自蛋白質(zhì)鑒定總數(shù)的比例總體上沒有明顯差異，且鑒定到的水稻葉片蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量均主要集中在11 ～50 kDa，與Muthurajan 等［23］和Zhao 等［24］的研究結(jié)果基本一致。由此可見，在針對不同相對分子質(zhì)量和pI 值蛋白質(zhì)的凈化中，采用親和去垢小柱法均能取得滿意的結(jié)果，而FASP 法和丙酮沉淀法對不同相對分子質(zhì)量和pI 值蛋白質(zhì)造成類似程度的損失。

2.3 水稻葉片蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果分析

在最佳的色譜、質(zhì)譜條件下，水稻葉片蛋白質(zhì)經(jīng)提取、SDS 裂解、親和去垢小柱凈化，酶解肽段經(jīng)納升級液相色譜-高分辨質(zhì)譜分析（典型的基峰色譜圖見圖4），再經(jīng)相關(guān)數(shù)據(jù)庫檢索，一次進(jìn)樣分析可鑒定多達(dá)588 種蛋白質(zhì)。

圖4 水稻葉片蛋白酶解液的基峰色譜圖Fig.4 Base peak chromatogram of protein trypsin degradation from rice leaves

研究表明，鑒定到2 個(gè)及以上的完整肽段，則其蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果具有極高的可信度［25］。為此，本文按肽段匹配數(shù)對563 種葉片蛋白質(zhì)（n ＝3）進(jìn)行分析，結(jié)果表明肽段匹配數(shù)≥2 的有296 種，占總數(shù)的一半以上，最多時(shí)肽段匹配數(shù)可達(dá)16 個(gè)。對肽段匹配數(shù)≥2 的296 種蛋白質(zhì)，按照其生物學(xué)功能進(jìn)行了分類（見圖5），其中主要包括結(jié)合活性（與ATP、鎂離子、鈣離子、鋅離子、銅離子、核糖核苷酸、血紅素等結(jié)合）、酶活性（異構(gòu)酶、氧化還原、水解酶、合成酶等）、轉(zhuǎn)移運(yùn)輸活性和結(jié)構(gòu)組成功能等，對應(yīng)的數(shù)量分別為113、90、20 和21 種。

圖5 水稻葉片中蛋白質(zhì)分子功能的分類Fig.5 Distribution of proteins of rice leaves classified by different molecular functions

表1 列舉了相對分子質(zhì)量為9.3 ～177.2 kDa和pI 為4.26 ～11.47 的4 種典型蛋白質(zhì)，其肽段匹配率（coverage）均在9%以上，且每種蛋白質(zhì)都含有2 個(gè)及以上的完整鑒定肽段（identified peptide numbers），彌補(bǔ)了傳統(tǒng)的凝膠電泳對極性較大蛋白質(zhì)、相對分子質(zhì)量較小或較大蛋白質(zhì)不能很好分離鑒定的不足。此外，核酮糖二磷酸羧化酶是評價(jià)葉片蛋白質(zhì)鑒定方法的特征蛋白質(zhì)［7］，序列號(hào)（Accession No.）為Q339G9 的核酮糖二磷酸羧化酶大亞基是該酶的重要組成部分；本文中該亞基對應(yīng)的肽段匹配數(shù)為12，肽段匹配率為29.01%，明顯優(yōu)于Islam等［26］肽段匹配數(shù)為5 的結(jié)果。

表1 4 種典型水稻葉片蛋白質(zhì)的鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of four typical proteins in rice leaves

3 結(jié)論

本文建立了基于親和去垢小柱凈化的水稻葉片蛋白質(zhì)分析鑒定方法。通過比較FASP 法、親和去垢小柱法和丙酮沉淀法對SDS 去除效率及對蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)3 種方法均有較好的SDS去除效果（去除效率均＞95%）；盡管3 種方法具有一定互補(bǔ)性，但以親和去垢小柱法鑒定的蛋白質(zhì)總數(shù)最多，分別是FASP 法和丙酮沉淀法的2.8 倍和1.8 倍。親和去垢小柱法極大地簡化了蛋白質(zhì)樣品制備的步驟，提高了結(jié)果的可靠性，實(shí)現(xiàn)了高通量分析，并對不同相對分子質(zhì)量和pI 值的蛋白質(zhì)均具有較好的凈化效果，一次進(jìn)樣分析可鑒定到588 種水稻葉片蛋白質(zhì)。本方法不僅可為開展水稻葉片蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供重要的技術(shù)支撐，還可為其他植物蛋白質(zhì)組學(xué)的研究技術(shù)提供重要的借鑒。

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