梁 翙，丁健民，劉小宇

1.中國人民解放軍第455 醫(yī)院普通外科，上海200052； 2.上海第二軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室

目前，胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚未完全明確，但是相關(guān)研究表明，在適宜的局部微環(huán)境下，游離癌細(xì)胞與腹膜間皮細(xì)胞相互黏附是其發(fā)生的基礎(chǔ)［1］。在眾多影響腫瘤局部微環(huán)境的因素中，某些炎癥因子與腫瘤發(fā)生、發(fā)展具有非常密切的關(guān)系，其中TNF-α 及IL-1β 是目前臨床研究的熱點(diǎn)。國內(nèi)外一系列臨床研究表明，TNF-α及IL-1β 表達(dá)于多種腫瘤的局部微環(huán)境中，且參與腫瘤生成、侵襲及轉(zhuǎn)移等多個(gè)過程［2］。因此，本研究以體外原代培養(yǎng)人腹膜間皮細(xì)胞為研究對(duì)象，對(duì)不同濃度TNF-α 和IL-1β 處理下對(duì)腹膜間皮細(xì)胞與胃癌細(xì)胞黏附的影響進(jìn)行檢測分析，采用Real-time 法對(duì)腹膜間皮細(xì)胞經(jīng)不同濃度TNF-α 及IL-1β 處理后，其黏附分子mRNA 的表達(dá)情況進(jìn)行檢測分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)正常大網(wǎng)膜組織。(2)主要試劑:TNFα 與IL-1β(購自北京邦定公司)，THERMOSCIPTTMRTPCR system(Gibco BRL)，Taq DNA 聚合酶(Promega)，10 mmol/L dNTP Mix(Gibco BRL)，PBS，戊二醛固定馬紅細(xì)胞(西格瑪公司)。

1.2 方法 (1)人腹膜間皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定:參考文獻(xiàn)［3］中報(bào)道的方法。(2)炎癥介質(zhì)刺激人腹膜間皮細(xì)胞:首先將穩(wěn)定培養(yǎng)的第1 代HPMCs 消化，然后使用DMEM/F12 培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸浮液接種于帶孔培養(yǎng)板中，于37 ℃及5% CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。將上述培養(yǎng)的細(xì)胞分為兩組，即TNF-α 處理組(無血清DMEM+不同濃度TNF-α)與IL-1β 處理組(無血清DMEM+不同濃度IL-1β)。兩組pH 相同，且根據(jù)培養(yǎng)基體積大小加入濃度為5%的FBS。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后將總RNA 進(jìn)行提取，并收集上清液［4］。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT) 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)為20 μl，具體反應(yīng)體系包括:模板RNA(3 μl)、5 ×Buffer(4 μl)、DTT(2 μl)、dNTP(1 μl)、Oligo dT(1 μl)、MMLV(1 μl)以及0.1%的DEPC 處理水(8 μl)。將以上試劑加入經(jīng)DEPC 處理后的0.2 ml 的EP 管之中，快速離心混勻(離心率為3 000 r/min)，于PCR 儀中37 ℃條件下反應(yīng)1 h，于95 ℃條件下滅活MMLV 約5 min，并于4 ℃條件下保存2 h［5］。

1.4 Real-time PCR 擴(kuò)增反應(yīng)

1.4.1 引物設(shè)計(jì):Real-time PCR 擴(kuò)增反應(yīng)的引物設(shè)計(jì)如表1 所示。VCAM-1 產(chǎn)物最大。

表1 Real-time PCR 擴(kuò)增反應(yīng)的引物設(shè)計(jì)Tab 1 The designing table of Real-time PCR amplification reaction

1.4.2 Real-time PCR 反應(yīng):反應(yīng)體系為20 μl，具體包括:SYBR GREEN SUPER-MIX(10 μl)、上下游引物(2 μl)、ROX-2(0.4 μl)、模板cDNA(2 μl)及滅菌蒸餾水(5.6 μl)。將上述體系按照次序加入到0.2 ml的EP 管中，于水浴上進(jìn)行，經(jīng)1 min 離心(離心率3 000 r/min)之后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 15.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以x-± s 表示，采用t 檢驗(yàn);P ＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同TNF-α 處理濃度下黏附分子ICAM-1、VCAM-1 及CD44 mRNA 的表達(dá)情況 隨著TNF-α處理濃度的逐漸增大，黏附分子ICAM-1、VCAM-1 及CD44 mRNA 的表達(dá)水平也隨之升高，且與對(duì)照組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，見表2)。

2.2 不同IL-1β 處理濃度下黏附分子ICAM-1、VCAM-1 及CD44 mRNA 的表達(dá)情況 隨著IL-1β處理濃度的逐漸增大，黏附分子ICAM-1、VCAM-1 及CD44 mRNA 的表達(dá)水平也隨之升高，且與對(duì)照組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，見表3)。

2.3 胃腺癌細(xì)胞株中不同黏附分子mRNA 表達(dá)情況

經(jīng)Real-time PCR 方法檢測結(jié)果顯示，人胃腺癌細(xì)胞株AGS、SGC-7901 及MKN-45 中的黏附分子LFA-1、VLA-4 及CD44 mRNA 均呈陽性表達(dá)(見表4)。

表2 不同TNF-α 處理濃度下黏附分子ICAM-1、VCAM-1 及CD44 mRNA 的表達(dá)情況(x- ±s)Tab 2 Adhesion molecules ICAM-1，VCAM-1 and CD44 mRNA expression after different concentrations of TNF-α treatment ( ±s)

表2 不同TNF-α 處理濃度下黏附分子ICAM-1、VCAM-1 及CD44 mRNA 的表達(dá)情況(x- ±s)Tab 2 Adhesion molecules ICAM-1，VCAM-1 and CD44 mRNA expression after different concentrations of TNF-α treatment ( ±s)

注:與對(duì)照組相比，* P ＜0.05。

組別ICAM-1 mRNA VCAM-1 mRNA CD44 mRNA對(duì)照組0.60 ±0.03 0.22 ±0.01 0.13 ±0.01 TNF-α 處理組1 ng/ml 0.77 ±0.04* 0.32 ±0.02* 0.22 ±0.03*5 ng/ml 0.95 ±0.06* 0.44 ±0.03* 0.39 ±0.02*10 ng/ml 1.35 ±0.07* 0.99 ±0.05* 0.78 ±0.03*

表3 不同IL-1β 處理濃度下黏附分子ICAM-1、VCAM-1 及CD44 mRNA 的表達(dá)情況(x- ±s)Tab 3 Adhesion molecules ICAM-1，VCAM-1 and CD44 mRNA expression after different concentrations of IL-1β treatment(x- ±s)

表4 不同人胃腺癌細(xì)胞株中CD44、VLA-4 及LFA-1 mRNA的表達(dá)情況(x- ±s)Tab 4 CD44，VLA-4 and LFA-1 mRNA expression in different human gastric cancer cell lines (x- ±s)

3 討論

近年來，我國胃癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，其死亡率較高，居惡性腫瘤第二位［6］。目前，臨床上普遍認(rèn)為導(dǎo)致胃癌患者病死的主要原因是胃癌術(shù)后癌細(xì)胞在腹膜中的轉(zhuǎn)移。按照腫瘤“種子-土壤“學(xué)說，胃癌腹膜轉(zhuǎn)移主要包括如下環(huán)節(jié)［7］:(1)胃癌細(xì)胞從原發(fā)病灶脫落;(2)腹腔中游離的胃癌細(xì)胞與腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生黏附作用;(3)胃癌細(xì)胞突破腹膜間皮屏障進(jìn)入間皮下基質(zhì)。其中胃癌腹膜種植轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)為腹腔內(nèi)游離的癌細(xì)胞能否與腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生黏附作用。

目前，臨床研究認(rèn)為影響胃癌術(shù)后腹腔粘連形成的主要因素包括［8］:(1)急性炎癥反應(yīng);(2)纖維蛋白出現(xiàn)溶解;(3)金屬蛋白酶及其抑制劑。當(dāng)腹部受到外界創(chuàng)傷如手術(shù)刺激，則首先會(huì)出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，其中最常見的一種是產(chǎn)生急性炎癥反應(yīng)，然后腹腔內(nèi)的多種炎性細(xì)胞及間皮細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生炎癥因子，而這些炎癥因子能夠隨腹膜液在腹腔中進(jìn)行自由地流動(dòng)，因此這些炎癥因子對(duì)腹腔內(nèi)黏附分子形成的影響具有十分重要的作用。目前，研究較多的炎癥因子為TNF-α 和IL-1β。相關(guān)研究［9］表明，TNF-α 與IL-1β 可通過巨噬細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞向創(chuàng)傷處進(jìn)行轉(zhuǎn)移，從而促進(jìn)了纖維蛋白交聯(lián)以及胞外基質(zhì)重塑，利于創(chuàng)傷的迅速愈合。而這些炎癥因子是否會(huì)促進(jìn)腹腔內(nèi)游離的胃癌細(xì)胞與腹膜組織之間發(fā)生黏附作用，目前臨床報(bào)道較少。

腫瘤壞死因子(TNF-α)，也可稱之為“惡病質(zhì)素”，屬于腫瘤壞死因子超家族的一種原型配體，具有眾多功能，在細(xì)胞炎癥反應(yīng)以及凋亡過程中具有十分重要的作用。TNF-α 可通過上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)白細(xì)胞黏附分子(LAM)而促進(jìn)炎癥細(xì)胞發(fā)生浸潤，且能夠?qū)ν淌杉?xì)胞的殺傷機(jī)制具有一定的活化作用，因此，TNF-α 在預(yù)防腹腔感染中具有十分重要的作用。近期，大量研究表明，TNF-α 參與腫瘤相關(guān)的炎癥反應(yīng)，且具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長的作用［10］。Rani 等［11］近期研究表明，TNF-α 能夠通過激活NF-κB 通路而具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖以及逃避殺傷等方面的作用。同時(shí)，Kulbe 等［12］研究表明，TNF-α 具有通過上調(diào)細(xì)胞趨化因子CXCR4 及ICAM-1 的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果表明，隨著TNF-α 處理濃度的逐漸增大，黏附分子ICAM-1、VCAM-1 及CD44 mRNA 的表達(dá)水平也隨之升高，且與對(duì)照組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

IL-1β 是IL-1 的一個(gè)亞型，主要由單核細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生，其他來源包括NK 細(xì)胞、血小板、內(nèi)皮細(xì)胞、巨核細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞等。目前研究表明，IL-1β 能夠提高對(duì)巨噬細(xì)胞等其他炎性細(xì)胞產(chǎn)生刺激性作用而介導(dǎo)多種炎癥因子的分泌，其中最常見的有IL-6 與IL-10 等。同時(shí)，它還可以通過誘導(dǎo)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌化學(xué)性趨化因子(MCP-1)來促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)多種黏附分子加以表達(dá)，例如ICAM-1、VCAM-1以及E-選擇素等。此外，IL-1β 還具有誘導(dǎo)細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)表達(dá)等方面的作用。ICAM-1 及MMPs 等蛋白在腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移過程中均具有十分重要的作用，因此，本研究結(jié)果表明IL-1β 與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過程關(guān)系密切。

綜上所述，炎癥因子促進(jìn)胃癌腹腔轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制為:炎癥因子TNF-α 與IL-1β 通過提高人腹膜間皮細(xì)胞黏附分子ICAM-1、VCAM-1 及CD44 mRNA 的表達(dá)水平促進(jìn)胃癌細(xì)胞與腹膜間皮細(xì)胞之間相互黏附，在胃癌細(xì)胞腹腔種植轉(zhuǎn)移中發(fā)揮正性促進(jìn)作用。

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