孫剛全，敖光第

（1.重慶市北碚區(qū)畜牧獸醫(yī)局天府獸醫(yī)站，重慶 北碚 400700；2.重慶市北碚區(qū)畜牧獸醫(yī)局，重慶 北碚 400700）

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 參考菌株。大腸桿菌CQYB3CE001、金黃色葡萄球菌MRSA252、沙門氏菌YBCSA015，由西南大學丁紅雷副教授惠贈。

1.1.2 主要試劑。麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱液體培養(yǎng)基購自杭州微生物試劑有限公司，DNA Marker III購自天根生化科技有限公司，2×Taq Master Mix購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.1.3 藥敏試紙。32種藥敏試紙購自杭州微生物試劑有限公司和杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集。在重慶市北碚區(qū)龍鳳橋鎮(zhèn)采集糞便標本共計15份，包括某豬場豬糞5份和某雞場雞糞10份，每份樣品均保證來自一個單獨的動物。采集樣品時用滅菌筷子挑取雞或豬的糞便0.5～1g置于5mL滅菌離心管中，迅速放入裝有冰袋的泡沫箱中，2h內運回實驗室進行樣品處理。

1.2.2 細菌分離。將盛有糞便的每個離心管加入3 mL PBS液，振蕩，使糞便充分混勻，然后將其劃線于麥康凱平板上，37℃恒溫箱內培養(yǎng)24h。隨后在每個麥康凱平板上各挑取一個具有典型大腸桿菌菌落特征的菌落，再次在麥康凱平板上劃線進行純培養(yǎng)。挑取純培養(yǎng)后的菌落，涂片，革蘭氏染色，然后于光學顯微鏡下觀察細菌形態(tài)。

1.2.3 分離菌株的PCR檢測

1.2.3.1 引物設計與合成。根據文獻報道的大腸桿菌特異性基因phoA，用引物設計軟件Primer Premier 5.0設計特異性引物。上游引物phoA-F：5′-CGATTC TGGAAATGGCAAAAG-3′，下游引物 phoA-R：5′-CGT GATCAGCGGTGACTATGAC-3′。引物由 Life Technologies公司合成。

1.2.3.2 模板制備。挑取經純培養(yǎng)且有典型大腸桿菌菌落特征的菌落接種于麥康凱液體培養(yǎng)基，37℃下220r/min培養(yǎng)8h。將新鮮培養(yǎng)的菌液2mL 10000r/min離心1min，棄上清；加入1mL ddH2O，重懸，迅速以10000 r/min離心1min，棄上清；加入50μL ddH2O，100℃處理10min。保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.3 PCR 反應體系。2×Taq Master Mix 12 μL，phoA-F（10μM）2μL，phoA-R（10μM）2μL，模板 1μL，ddH2O 7μL，總反應體系 24μL。

1.2.3.4 PCR反應條件。94℃預變性5min；94℃變性20s，58℃退火 20s，72℃延伸 45s，共 30個循環(huán)；最后72℃延伸6min。反應結束后取5μL反應產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像系統(tǒng)儀上觀察結果。以大腸桿菌CQYB3CE001為陽性對照，金黃色葡萄球菌MRSA252和沙門氏菌YBCSA015作為陰性對照。

1.2.4 藥物敏感性試驗。根據《抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標準》進行判定。37℃培養(yǎng)18h后觀察結果。

2 結果

2.1 菌株分離情況、菌落形態(tài)及染色特征 經純培養(yǎng)的細菌在麥康凱平板上呈圓形、扁平、邊緣整齊、表面光滑、濕潤的鮮桃紅色菌落。將此15株細菌進行革蘭氏染色后鏡檢，發(fā)現15株臨床分離菌均為散在排列的兩端鈍圓的革蘭氏陰性桿菌。無論菌落形態(tài)還是菌株形態(tài)，均提示這些細菌可能為大腸桿菌。

2.2 分離菌株的PCR鑒定 PCR檢測結果表明陽性對照和所有臨床分離株均能擴增出720bp的預期條帶，陰性對照沒有擴增出任何片段（見圖1）。因此，可判斷所有15株細菌均為大腸桿菌。

圖1 大腸桿菌PCR鑒定結果

2.3 藥物敏感性試驗 試驗結果表明：15株大腸桿菌均對青霉素G、氨芐西林、阿莫西林、羧芐青霉素、頭孢拉定、頭孢唑啉、四環(huán)素、林可霉素、羅紅霉素、甲氧芐氨嘧啶、磺胺甲基異惡唑、萬古霉素12種藥物耐藥，特別是對所有的青霉素類抗生素和磺胺類藥物耐藥。10株雞源性大腸桿菌對頭孢哌酮、卡那霉素、新霉素、恩諾沙星、乳酸環(huán)丙沙星、氟苯尼考完全耐藥或中度敏感，大部分菌株對妥布霉素、紅霉素、鏈霉素、呋喃唑酮、慶大霉素和氧氟沙星耐藥；而5株豬源性大腸桿菌僅對諾氟沙星、丁胺卡那霉素、妥布霉素、慶大霉素4種藥物敏感。15株細菌的耐藥率在43.75%～93.75%之間，14株細菌的耐藥率超過50%，超過2/3的菌株對23種藥物耐藥。通過表1可見，32種抗菌藥物的耐藥菌株比例從13.3%到100%不等，所有菌株均對其中12種藥物耐藥，占到所測試藥物的37.5%。

3 討論

本試驗首先建立了一種用于大規(guī)模分離并快速鑒定畜禽糞便中大腸桿菌的方法。phoA基因存在于所有大腸桿菌中，而且在不同菌株間的序列有高度保守性，因此根據該基因在不同菌株間保守的核苷酸序列設計引物進行PCR檢測，可以鑒定出是否是大腸桿菌。另外，本試驗通過高溫水煮的方法獲得了PCR擴增的DNA模板，省時省力，降低了實驗成本，適合基層獸醫(yī)站應用。用合成的特異性引物采用PCR法擴增大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌中的phoA基因，結果大腸桿菌擴增出720bp左右的條帶，沙門氏菌和金黃色葡萄球菌未擴增出相應條帶，證明phoA為大腸桿菌特有的基因。

表1 分離菌株對不同抗菌藥物的耐藥比例

本實驗中所有分離菌株對12種抗菌藥物完全耐藥，超過2/3的菌株對超過23種藥物耐藥。如此之高的耐藥率大大超出了我們的預料，說明采樣地區(qū)的養(yǎng)殖場內的大腸桿菌耐藥率相當高。因此，在今后的工作中，基層獸醫(yī)站應加強對本轄區(qū)內養(yǎng)殖場抗生素使用的監(jiān)管，根據藥敏試驗結果指導養(yǎng)殖場制定合理的用藥方案，正確有效地使用抗菌藥物。

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