梁 曼， 鄧 晟， 張 昕， 林 玲

(1.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210046;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，江蘇 南京 210014)

大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)引起的棉花黃萎病已成為中國棉花生產(chǎn)上的第一大病害，是棉花可持續(xù)生產(chǎn)的主要障礙之一。微菌核是病原菌在土壤中的主要存活結(jié)構(gòu)和病害的初侵染來源，也是病害防治的直接靶標(biāo)［1-2］。因此，明確微菌核形成和發(fā)育的機制對于深入研究棉花黃萎病的流行規(guī)律和制定防治措施具有重要意義。前人對于大麗輪枝菌微菌核的研究主要集中于微菌核的形態(tài)、大小、分布，微菌核的分離培養(yǎng)技術(shù)以及影響微菌核萌發(fā)與存活的因素等［2-4］。但是，對于調(diào)控大麗輪枝菌微菌核發(fā)育的內(nèi)在分子機理研究的很少。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT)技術(shù)已成為研究真菌基因功能的有效工具之一，通過ATMT方法將T-DNA隨機插入至真菌基因組中構(gòu)建突變體庫，并根據(jù)突變體的表型篩選獲得相關(guān)功能基因，已成功運用于多種植物病原真菌的功能基因研究［5-7］。江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所土傳種傳病害實驗室同樣用ATMT方法，將自己構(gòu)建的雙向GFP啟動子誘捕載體1300-bisGFP-hyg轉(zhuǎn)入大麗輪枝菌菌絲型強致病力菌株V07DF2中，構(gòu)建了包含6 000個轉(zhuǎn)化子的T-DNA插入突變體庫。從其中60個轉(zhuǎn)化子中篩選出6個喪失致病力和11個致病力顯著降低的突變體菌株，并對其中1個致病力顯著降低的突變體菌株24C9進行了深入的分析，該菌株為單拷貝 T-DNA插入，插入位點為 VdUGPU基因(VDAG_03025)的啟動子區(qū)域［8］。但是從該突變體庫中的1 000個轉(zhuǎn)化子中僅篩選獲得1株微菌核發(fā)育異常的突變體菌株43F11，該突變株為雙拷貝TDNA插入，在查氏-根培養(yǎng)基上培養(yǎng)一個月后能夠產(chǎn)少量黑色微菌核，但在查氏平板上生長與野生型V07DF2一致，不產(chǎn)生微菌核。為了獲得更多的微菌核發(fā)育異常的突變體菌株，就需要進一步擴建大麗輪枝菌T-DNA插入突變體庫。

由于大麗輪枝菌的菌落形態(tài)變異很大，根據(jù)在PDA培養(yǎng)基上生長時形成微菌核的多少可將大麗輪枝菌分為不產(chǎn)微菌核的菌絲型、產(chǎn)生少量黑色微菌核的中間型和產(chǎn)生大量黑色微菌核的菌核型這3種培養(yǎng)類型［9］。為此，我們用同樣的方法，將雙向GFP啟動子誘捕載體1300-bisGFP-hyg轉(zhuǎn)入菌核型菌株V08DF1中，并同時用1300-HYG-sGFP熒光標(biāo)記載體轉(zhuǎn)化V08DF1，構(gòu)建大麗輪枝菌菌核型菌株V08DF1的突變體庫，試圖從菌絲型菌株V07DF2庫中篩選出能夠產(chǎn)生微菌核的突變體菌株，并從菌核型菌株V08DF1庫中找出微菌核發(fā)育受阻的突變體菌株，為進一步克隆微菌核發(fā)育相關(guān)的基因及揭示微菌核形成和發(fā)育的機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 大麗輪枝菌菌核型菌株V08DF1，分離自江蘇棉花黃萎病病株，保存于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所。農(nóng)桿菌菌株AGL-1由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所張保龍研究員惠贈。1300-bisGFP-hyg雙向GFP啟動子誘捕載體［8］和 1300-HYG-sGFP 熒光標(biāo)記載體［10］由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所保存。

1.1.2 試劑 潮霉素(Hygromycin，hyg)B和Southern雜交試劑盒來源于 Roche公司。PCR體系(TransTaq DNA Polymerase High Fidelity)購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。其他常規(guī)試劑及抗生素均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 大麗輪枝菌菌株V08DF1對潮霉素的耐受性檢測 采用PDA平板培養(yǎng)，設(shè)置潮霉素質(zhì)量濃度梯度為 0 μg/ml、25 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml、150 μg/ml、200 μg/ml，每個梯度 3 次重復(fù)，接種大麗輪枝菌菌株V08DF1，置于25℃恒溫條件下，黑暗培養(yǎng)14 d，觀察菌落生長情況。

1.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子的保存農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大麗輪枝菌的轉(zhuǎn)化參見已報道的方法［8］，大麗輪枝菌菌株 V08DF1分別用1300-bisGFP-hyg雙向GFP啟動子誘捕載體和1300-HYG-sGFP熒光標(biāo)記載體進行轉(zhuǎn)化。挑取在硝酸纖維素膜上長出的轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)接至裝有含50 μg/ml潮霉素B、200 μg/ml頭孢噻肟和 200 μg/ml羧芐青霉素的 PDA的96孔平板上，然后對陽性轉(zhuǎn)化子進行單孢分離，-70℃保存在含25%甘油的PDA液體培養(yǎng)基中，即獲得了大麗輪枝菌菌株V08DF1的T-DNA插入轉(zhuǎn)化子。

1.2.3 微菌核發(fā)育異常突變體菌株的篩選 對采用1300-bisGFP-hyg雙向GFP啟動子誘捕載體構(gòu)建的1 000個轉(zhuǎn)化子用由查氏和查氏-根培養(yǎng)基進行篩選。查氏-根培養(yǎng)基是在傳統(tǒng)查氏培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入棉花根物質(zhì)，具體制備步驟參照Deng等［8］的方法進行，通過啟動子捕獲模塊找到參與微菌核發(fā)育相關(guān)的基因。對采用1300-HYG-sGFP熒光標(biāo)記載體構(gòu)建的1 000個轉(zhuǎn)化子由查氏與PDA培養(yǎng)基進行篩選，分別吸取5 μl-70℃保存的轉(zhuǎn)化子，滴在查氏、查氏-根或PDA固體培養(yǎng)基的中央，25℃黑暗培養(yǎng)30 d，每隔7 d觀察各轉(zhuǎn)化子的菌落形態(tài)，比較其菌落直徑、菌絲形態(tài)、氣生菌絲多少、是否產(chǎn)生色素、是否產(chǎn)生微菌核等培養(yǎng)特性，比較其生物學(xué)特性與野生型菌株的差異。從中篩選出產(chǎn)微菌核能力與野生型菌株明顯不同的突變體菌株，即找出微菌核發(fā)育受阻，不產(chǎn)微菌核的突變體菌株。

1.2.4 微菌核發(fā)育異常突變體菌株T-DNA插入的PCR驗證 微菌核發(fā)育異常的突變體菌株在PDA液體培養(yǎng)基中，25℃、150 r/min，培養(yǎng)7 d后，取新鮮菌絲提取基因組DNA。根據(jù)轉(zhuǎn)化載體中T-DNA片段上的潮霉素抗性基因設(shè)計特異性引物［11］，HYG檢測上游引物:5'-GACAGCGTCTCCGACCTGATGC-3'，HYG檢測下游引物:5'-TGGGGCGTC GGTTTCCACTATC-3'，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為25 μl:H2O 16.25 μl、DNA 2.00 μl、HYG-S 1.00 μl、HYG-A 1.00 μl、BuffeⅠ(含 Mg2+)2.50 μl、dNTP Mixture 2.00 μl、Taq DNA Polymerse 0.25 μl;反應(yīng)條件為 95℃預(yù)變性5 min;95℃變性1 min，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結(jié)果。

1.2.5 微菌核發(fā)育異常突變體菌株T-DNA插入拷貝數(shù)的驗證 使用Roche公司的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ試劑盒分析T-DNA插入的拷貝數(shù)。各步驟均按照試劑盒說明書進行，首先，用HYG檢測引物擴增943 bp潮霉素抗性基因片段用于合成雜交探針，接下來將微菌核發(fā)育異常突變體的gDNA(約25 μg)分別用BstX I、HindⅢ37℃過夜完全酶切，并將酶切產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳，然后用毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法將核酸轉(zhuǎn)移并固定于尼龍膜上，最后，在尼龍膜上進行雜交與顯色。

2 結(jié)果

2.1 大麗輪枝菌菌核型菌株V08DF1突變體庫的構(gòu)建

在開始進行ATMT轉(zhuǎn)化大麗輪枝菌菌核型菌株V08DF1試驗之前，先檢測菌株V08DF1對潮霉素B的耐受性。結(jié)果顯示，于25℃，在PDA培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)14 d后，潮霉素B質(zhì)量濃度梯度為50 μg/ml時，即可抑制V08DF1的生長，其對潮霉素B耐受性的檢測結(jié)果與V07DF2一致。

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化對大麗輪枝菌菌核型菌株V08DF1進行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率為1.60×10-4。對轉(zhuǎn)化子進行單孢分離保存，建立了大麗輪枝菌菌核型菌株V08DF1的突變體庫，共保存2 000個轉(zhuǎn)化子，其中包括用1300-bisGFP-hyg雙向GFP啟動子誘捕載體轉(zhuǎn)化獲得的1 000個轉(zhuǎn)化子，以及用1300-HYG-sGFP熒光標(biāo)記載體轉(zhuǎn)化獲得的1 000個轉(zhuǎn)化子。

2.2 轉(zhuǎn)化子菌落形態(tài)的觀察及微菌核發(fā)育異常突變體菌株的篩選

對1 000個用1300-bisGFP-hyg雙向GFP啟動子誘捕載體進行轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子采用查氏和查氏-根培養(yǎng)基進行培養(yǎng)14 d后，觀察各轉(zhuǎn)化子的菌落特征，結(jié)果顯示，41個突變體菌株的菌落特征與野生型菌株V08DF1有明顯差異，包括11個菌落直徑明顯變小的突變體菌株，12個菌落中菌絲稀疏的突變體菌株，12個沒有氣生菌絲的突變體菌株，1個產(chǎn)紅色素的突變體菌株和5個微菌核發(fā)育異常的突變體菌株。在這5個微菌核發(fā)育異常的突變體菌株中，突變體菌株5G4在查氏和查氏-根培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d后，均不產(chǎn)生微菌核，而其余4個微菌核發(fā)育異常突變體菌株9G4、10E1、11A6、11B7只在查氏平板上不產(chǎn)生微菌核，而在查氏-根培養(yǎng)基仍然能夠產(chǎn)生少量微菌核(圖1)。

對1 000個用1300-HYG-sGFP熒光標(biāo)記載體進行轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子采用PDA和查氏培養(yǎng)基進行篩選，培養(yǎng)14 d后發(fā)現(xiàn)89個突變體菌株的菌落特征與野生型菌株V08DF1有明顯差異，部分菌落形態(tài)異常突變體菌株表型如圖2所示，包括19個菌落直徑明顯變小的突變體菌株，25個菌落中菌絲稀疏的突變體菌株，27個沒有氣生菌絲的突變體菌株，4個產(chǎn)紅色素的突變體菌株，5個菌絲顏色微黃的突變體菌株和9個微菌核發(fā)育異常的突變體菌株。在這9個微菌核發(fā)育異常的突變體菌株中，2H3和12I3這2個突變體菌株在PDA和查氏平板上培養(yǎng)14 d都不產(chǎn)生微菌核，其余7個微菌核發(fā)育異常突變體菌株1C2、6I7、7E6、10B5、11C3、11G3、12C8 只在查氏平板上不產(chǎn)生微菌核，而在PDA平板上與野生型V08DF1一致，產(chǎn)生大量黑色微菌核，部分微菌核異常的突變體菌株表型如圖3所示。

圖1 用查氏和查氏-根培養(yǎng)基篩選V08DF1庫中微菌核發(fā)育異常的突變體菌株Fig.1 The mutants with abnormal microsclerotia development screened from V08DF1 library on Czapek-Dox medium and Czapek-Dox plus cotton root extract medium

圖2 V08DF1庫中菌落形態(tài)異常的突變體菌株Fig.2 The mirphological mutants in V08DF1 library

圖3 用查氏和PDA培養(yǎng)基篩選V08DF1庫中微菌核發(fā)育異常的突變體菌株Fig.3 The mutants with abnormal microsclerotia development screened from V08DF1 library on PDA medium and Czapek-Dox medium

2.3 微菌核發(fā)育異常突變體菌株T-DNA插入的PCR驗證

對篩選出的14個微菌核發(fā)育受阻，不產(chǎn)生微菌核的突變體菌株 1C2、2H3、5G4、6I7、7E6、9G4、10B5、10E1、11A6、11B7、11C3、11G3、12C8、12I3進行T-DNA插入的PCR驗證。以這些突變體菌株的基因組DNA為模板，均能PCR擴增出943 bp的潮霉素抗性基因(圖4)。由此斷定，T-DNA已經(jīng)整合到基因組DNA中，成功實現(xiàn)了轉(zhuǎn)化。

圖4 PCR檢測微菌核發(fā)育異常突變體菌株的潮霉素抗性基因Fig.4 Detection of hygromycin B resistance gene in the mutants with abnormal microsclerotia development by PCR amplification

2.4 微菌核發(fā)育異常突變體T-DNA插入拷貝數(shù)的驗證

通過Southern雜交對篩選出的14個微菌核發(fā)育異常的突變體菌株進行T-DNA插入拷貝數(shù)的驗證。結(jié)果顯示，7個微菌核發(fā)育異常的突變體菌株為單拷貝，分別為 1C2、2H3、6I7、10B5、10E1、12C8、12I3;5 個為雙拷貝，分別為 5G4、7E6、9G4、11C3、11G3;2個為三拷貝，分別為11A6、11B7。單拷貝插入的微菌核異常突變體菌株的Southern雜交結(jié)果如圖5所示。

3 討論

最近幾年來，隨著大麗輪枝菌基因組序列的測定和基因表達信息的豐富，系統(tǒng)插入突變技術(shù)、基因敲除技術(shù)的應(yīng)用，極大推動了大麗輪枝菌微菌核形成發(fā)育分子機制的研究，但總體仍處于起步階段。目前，已報道的與微菌核發(fā)育相關(guān)的基因只有為數(shù)不多的幾個，并且大多與致病性相關(guān)。通過基因敲除驗證，發(fā)現(xiàn)參與大麗輪枝菌微菌核發(fā)育并且與致病性相關(guān)的基因有7個，分別為VMK1(編碼促分裂素原活化蛋白激酶)［12］、VdPKAC1(編碼 cAMP依賴性蛋白激酶 A 的催化亞基)［11，13］、VdGARP1(編碼 1個富含谷氨酸的蛋白質(zhì))［14］、VdSNF1(編碼蔗糖非發(fā)酵蛋白質(zhì)激酶)［15］、VGB(編碼 G蛋白質(zhì)的 β 亞基)［16］、Vta2(編碼粘附的轉(zhuǎn)錄激活因子)［17］和VdMsb(編碼1種跨膜粘蛋白質(zhì))［18］。另外還有1個基因VMK1(編碼1種真菌疏水蛋白質(zhì))參與了大麗輪枝菌微菌核的形成，但不是致病必需的因子［19-20］。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的這些基因僅僅揭開了大麗輪枝菌微菌核發(fā)育機制的冰山一角，外界環(huán)境和內(nèi)在因子引發(fā)大麗輪枝菌微菌核發(fā)育的途徑、靶標(biāo)位點以及作用方式都還需要進一步揭示。

圖5 微菌核發(fā)育異常突變體菌株的Southern雜交分析Fig.5 Southern-blot analysis of T-DNA insertion in the mutants with abnormal microsclerotia development

正向遺傳學(xué)途徑研究基因功能的方法是在獲得功能喪失突變體的基礎(chǔ)上分離和鑒定控制該表型的基因。我們通過ATMT方法將T-DNA隨機插入至大麗輪枝菌基因組中，建立了大麗輪枝菌菌核型菌株V08DF1的T-DNA插入突變體庫，從2 000個轉(zhuǎn)化子中篩選出14個微菌核發(fā)育異常的突變體菌株，表明這些突變體菌株中與微菌核形成發(fā)育相關(guān)的基因，被T-DNA的插入破壞了。進一步通過Southern雜交，篩選出7個單拷貝插入的突變體菌株1C2、2H3、6I7、10B5、10E1、12C8 和 12I3，表明這 7 個被T-DNA插入破壞的基因是大麗輪枝菌微菌核形成發(fā)育過程中的關(guān)鍵基因，這些突變體菌株是研究大麗輪枝菌微菌核形成發(fā)育機制的好材料。

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