鄭 金， 陳 滔，， 陸吉虎， 高 峰，， 候繼波， 黎滿香， 唐應(yīng)華

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院/國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京210014)

減蛋下降綜合征(EDS)是由減蛋下降綜合征病毒(EDS virus，EDSV)引起的以產(chǎn)蛋率下降為特征的傳染病。本病的主要傳播方式是垂直傳播，也可通過呼吸道水平傳播。所有年齡的雞均可感染，但幼雞感染后不表現(xiàn)任何臨床癥狀，母雞只是在產(chǎn)蛋高峰期表現(xiàn)明顯［1］。EDSV由11條大小不等的蛋白質(zhì)組成，纖突蛋白質(zhì)是EDSV的主要衣殼蛋白質(zhì)，纖突蛋白質(zhì)包括3個(gè)結(jié)構(gòu)域，即Tail、Shaft和Knob區(qū)，Knob區(qū)不但可識(shí)別宿主細(xì)胞受體而且能增強(qiáng)病毒的吸附能力［2］，Knob-S蛋白質(zhì)存在良好的免疫原性［3］。

本試驗(yàn)選用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)EDSV的Knob-S蛋白質(zhì)進(jìn)行真核表達(dá)、純化，經(jīng)Western blotting和間接免疫熒光分析，確定表達(dá)的蛋白質(zhì)具有免疫原性，為研究Knob-S蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性及相關(guān)疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株、細(xì)胞、試驗(yàn)動(dòng)物

大腸桿菌DH5α、pFastBac-1、轉(zhuǎn)座用大腸桿菌宿主菌 DH10Bac、pMD18-T-Knob-S、草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞(Spodoptera frugiperda)均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院保存。6周齡非免海蘭褐雛雞，購(gòu)自北京華都峪口禽業(yè)集團(tuán)。

1.2 主要試劑

EDSV-76由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心保存。BamHⅠ、HindⅢ工具酶、Ex Taq DNA 聚合酶、IPTG、DNA marker DL2000、DL15000、蛋白質(zhì) Marker、X-gal、T4 DNA 連接酶、DNA膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒均購(gòu)自寶生物工程有限公司，優(yōu)級(jí)胎牛血清、Grace’s培養(yǎng)基、Sf-900ⅡSFM培養(yǎng)液、LipofectamineTM2000均購(gòu)自Invitrogen公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗雞的抗體為Promega公司產(chǎn)品，DMEM與RPMI1640培養(yǎng)基為GIBCO公司產(chǎn)品，細(xì)胞培養(yǎng)板為Costar公司產(chǎn)品，其余試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

以EDSV-76疫苗株為模版，根據(jù)已發(fā)表的纖突蛋白質(zhì)Knob-S氨基酸序列，利用Primer Premier 5.0生物軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物，于上、下游引物分別引入BamHⅠ、HindⅢ酶切位點(diǎn)，F(xiàn):5'-GCGGGATCCCA TGTTGACTTTGGCTTATGATTCCAC-3'，R:5'-ATAAAGCTTCTACTGTGCTCCAACATATG-3'，下劃線部分為酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)為708 bp，引物由南京金斯瑞生物科技公司合成。

1.4 Knob-S基因的擴(kuò)增、克隆

提取pMD18-T-Knob-S質(zhì)粒，作為PCR擴(kuò)增的模板，產(chǎn)物經(jīng)10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳鑒定和切膠回收后連接到pMD18-T中，轉(zhuǎn)化于DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取白斑，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR和酶切鑒定。鑒定正確的質(zhì)粒送上海美吉生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為p-Knob-S。

1.5 重組桿狀病毒的構(gòu)建

將重組質(zhì)粒p-Knob-S和pFastBac-1質(zhì)粒用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，回收目的片段連接獲得重組轉(zhuǎn)座載體pFast-Knob-S。將重組質(zhì)粒pFast-Knob-S轉(zhuǎn)化入DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，獲得插入Knob-S基因的重組桿狀病毒穿梭載體rBac-Knob-S。3次藍(lán)白斑篩選純化后，按 Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)說明書中改良的堿裂解法提取重組Bacmid的DNA，用M13上、下游通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確定目的基因插入是否成功。將rBac-Knob-S在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，感染4～5 d時(shí)，收集出現(xiàn)明顯感染癥狀的細(xì)胞上清液，作為第1代重組病毒，傳代3次后篩選到含有Knob-S基因的重組桿狀病毒rAcV-Knob-S種子液。

1.6 重組桿狀病毒滴度的測(cè)定

取10支1.5 ml滅菌EP管，每管中加入含有2%FBS 的 Grace’s培養(yǎng)基 900 μl，在第一管中加入100 μl第3代病毒原液，倍比稀釋至第10管，最高稀釋度為1×10-10，棄去已鋪好的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)的培養(yǎng)液，用Grace’s培養(yǎng)基清洗1遍，每列細(xì)胞板依次加入100 μl所稀釋的病毒滴度，最后兩列為陰性對(duì)照，對(duì)照內(nèi)加入 100 μl含有 2%FBS的Grace’s培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱內(nèi)，觀察細(xì)胞狀態(tài)并記錄陽性孔中細(xì)胞病變情況，直到陰性細(xì)胞脫落老去，結(jié)果按Karber法計(jì)算。

1.7 Western blotting和間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)重組Knob-S基因在Sf9細(xì)胞中的表達(dá)

收集rBac-Knob-S感染后4～5 d的病變細(xì)胞，用PBS洗滌3次后，再用 PBS重懸，進(jìn)行 Western blotting［4］。收集 rBac-Knob-S感染后完全病變的細(xì)胞，同時(shí)以未感染的Sf9昆蟲細(xì)胞和與空桿狀病毒感染的Sf9昆蟲細(xì)胞為對(duì)照，固定后用雞抗EDSV陽性血清和FITC標(biāo)記的羊抗雞二抗檢測(cè)表達(dá)蛋白質(zhì)，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.8 抗原的制備

重組桿狀病毒調(diào)整到濃度為1 ml 1×106.0TCID50后，按每1 ml病毒接種100 ml的細(xì)胞(細(xì)胞密度約為1 ml 1×106個(gè))，共接種200 ml細(xì)胞，接毒后96～120 h收獲細(xì)胞，PBS洗3次，10 ml PBS重懸(濃縮20倍)，超聲裂解，4℃以5 000 r/min離心10 min，棄掉沉淀。

1.9 疫苗的制備及動(dòng)物免疫

將重組蛋白質(zhì)經(jīng)初步離心純化后與吐溫混合制備水相，將此水相與油相按 1∶3(體積比)混合并充分乳化，制成油乳劑疫苗并于4℃冰箱放置。將30只6周齡非免海蘭褐雛雞隨機(jī)分成3組，每組10只，桿狀病毒表達(dá)蛋白質(zhì)各組每羽份免疫0.3 ml(含50 μg的重組病毒)。免疫后第2、3、4和5周分別采血檢測(cè)抗體效價(jià)。另設(shè)空Bacmid轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞對(duì)照組和不免疫空白對(duì)照組。免疫后第 2、3、4和 5周分別采血，以EDS-76病毒作為檢測(cè)抗原，檢測(cè)血清血凝抑制抗體(HI)效價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 重組穿梭載體的構(gòu)建及鑒定

分別以 rBac-Knob-S和 rBac-pFast為模板，用M13通用引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出的重組空載體大小為2 430 bp，重組載體大小為3 000 bp左右，與預(yù)期結(jié)果相符(圖1)。

圖1 重組rBac-Knob-S PCR鑒定Fig.1 Ⅰdentification for the recombinant rBac-Knob-S with PCR

2.2 重組桿狀病毒滴度的測(cè)定

用Karber法計(jì)算病毒滴度，結(jié)果表明，前5個(gè)病毒稀釋度產(chǎn)生的細(xì)胞病變率為 100%，10-6、10-7、10-8、10-9、10-10稀釋的病毒產(chǎn)生的細(xì)胞病變率分別為 75.0%、37.5%、0、0 和0。

根據(jù)細(xì)胞的病變率計(jì)算重組桿狀病毒的病毒滴度，病毒滴度用組織培養(yǎng)半數(shù)感染量(TCID50)表示。

lgTCID50=L+d(S-0.5)

L:最低稀釋度對(duì)數(shù)，為-1;d:稀釋度對(duì)數(shù)之間的差值，為-1;S:陽性孔比率總和，為1+1+1+1+1+0.75+0.375+0=6.125。

即0.1ml重組桿狀病毒的TCID50為10-6.625。

2.3 重組蛋白質(zhì)Western blotting鑒定

經(jīng)Western blotting檢測(cè)，重組桿狀病毒表達(dá)產(chǎn)物轉(zhuǎn)印反應(yīng)后出現(xiàn)特異性蛋白質(zhì)雜交帶(圖2)，表明利用桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞Sf9內(nèi)表達(dá)的重組蛋白質(zhì)可與雞陽性血清發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，從而證實(shí)其具有生物學(xué)活性。

圖2 重組桿狀病毒表達(dá)蛋白質(zhì)的Western blotting鑒定Fig.2 Western blotting analysis of recombinant rBac-Knob-S

2.4 間接免疫熒光檢測(cè)

經(jīng)IFA檢測(cè)，rBac-Knob-S感染的Sf9細(xì)胞具有很強(qiáng)的特異性熒光(圖3A)，而健康Sf9細(xì)胞(圖3B)無熒光，桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞(圖3C)無熒光，說明Knob-S基因得到表達(dá)，并且表達(dá)產(chǎn)物位于細(xì)胞內(nèi)。

2.5 血清中HI抗體的檢測(cè)

重組Knob-S蛋白質(zhì)免疫后第2、3、4和5周采血，分離血清，HI檢測(cè)的抗體效價(jià)見表1，結(jié)果顯示，重組Knob-S蛋白免疫后第2周即可產(chǎn)生較高抗體，

圖3 重組病毒的間接免疫熒光(ⅠFA)檢測(cè)Fig.3 Ⅰdentification of recombinant bacmid by indirect immunofluorescence assay

表1 抗EDSV HⅠ抗體效價(jià)Table 1 The hemagglutinin inhibition(HⅠ)antibody titers against EDSV

3 討論

目前減蛋下降綜合征病毒(EDSV)的疫苗是EDSV用鴨胚增殖，并滅活制備成油苗，用以預(yù)防EDS-76，現(xiàn)階段并無SPF鴨胚用于繁殖病毒，若滅活不完全，則有可能造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，存在很大的安全隱患。利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(BEVS)體外表達(dá)具有生物活性蛋白質(zhì)國(guó)內(nèi)外均有文獻(xiàn)報(bào)道［5-10］，該系統(tǒng)具有對(duì)外源蛋白質(zhì)加工后修飾的功能，容易從無血清培養(yǎng)上清液中純化蛋白質(zhì)，無內(nèi)毒素污染等優(yōu)點(diǎn)。該系統(tǒng)與大腸桿菌等原核表達(dá)的外源蛋白質(zhì)相比能更好保持其免疫原性。

本試驗(yàn)以AV-127株基因組為模板，利用PCR方法擴(kuò)增纖突蛋白質(zhì)基因的Knob-S區(qū)，將其克隆到真核表達(dá)載體pFastBac1中，經(jīng)雙酶切證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建正確后構(gòu)建穿梭載體rBac-Knob-S，經(jīng)三輪篩選后得到陽性菌落，提取病毒基因組轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，在細(xì)胞中可見很強(qiáng)的亮綠色熒光，說明在Sf9細(xì)胞中高效表達(dá)了該蛋白質(zhì)。病毒的滴度測(cè)定結(jié)果表明，重組Knob-S病毒感染Sf9細(xì)胞后，細(xì)胞出現(xiàn)病變死亡，說明融合表達(dá)的Knob-S蛋白質(zhì)有細(xì)胞毒性。通過Western blotting檢測(cè)，確定了Knob-S蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性，與預(yù)期結(jié)果相符，表明表達(dá)的蛋白質(zhì)具有與天然蛋白質(zhì)相似的構(gòu)象和相同抗原性。動(dòng)物免疫試驗(yàn)結(jié)果表明，真核表達(dá)重組蛋白質(zhì)的抗體效價(jià)較高，說明該真核表達(dá)蛋白質(zhì)具有較好的免疫原性。

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