崔晉龍，郭婷婷,2，王俊宏，王夢(mèng)亮,*

（1.山西大學(xué)應(yīng)用化學(xué)研究所，山西 太原 030006；2.山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，山西 太原 030006）

一株柴胡紅景天中內(nèi)生真菌的抗氧化活性

崔晉龍1，郭婷婷1,2，王俊宏1，王夢(mèng)亮1,*

（1.山西大學(xué)應(yīng)用化學(xué)研究所，山西 太原 030006；2.山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，山西 太原 030006）

對(duì)柴胡紅景天中一株具有抗氧化活性的內(nèi)生真菌Rb-R-1進(jìn)行研究，獲得其分類地位并評(píng)價(jià)抗氧化活性強(qiáng)弱。結(jié)果表明：這株真菌為Ascomacota門Hypocreales目Neonectria屬的N. ramulariae真菌，具有較強(qiáng)的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羥自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-·）、NO2-清除能力和Fe2+螯合能力，IC50值分別為8.86、4.40、9.65、16.53、1.91 mg/mL；其發(fā)酵產(chǎn)物中總酚和總黃酮含量分別達(dá)18.12、22.48 mg/g。發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果表明，在以乳糖為碳源、牛肉膏為氮源、裝液量90 mL/250 mL、pH 7.0、25℃條件下培養(yǎng)10 d時(shí)，內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除率最大，達(dá)到93.12%；總酚和總黃酮含量最高，分別為19.14 mg/g和28.25 mg/g。

柴胡紅景天；內(nèi)生真菌；抗氧化；發(fā)酵條件優(yōu)化

高山植物紅景天（Rhodiola roseaL.）是2002年我國(guó)衛(wèi)生部頒布的“關(guān)于進(jìn)一步規(guī)范保健食品原料管理的通知（衛(wèi)法監(jiān)發(fā)[2002]51）”中規(guī)定的“可用于保健食品的物品”之一，也是世界許多民族長(zhǎng)期使用的抗氧化植物藥和食品添加原料[1]。在我國(guó)，紅景天主要分布于海拔超過(guò)3 000 m的高寒、強(qiáng)紫外線輻射、多風(fēng)的青藏高原等山區(qū)[2]，其主要化學(xué)成分有40多種，包括苯丙烷類、苯乙醇及它們的衍生物[2-3]如紅景天苷、酪醇等[3]，許多屬于酚類、黃酮類物質(zhì)的范疇，這賦予了紅景天良好的以抗氧化和抗缺氧雙向調(diào)節(jié)為基礎(chǔ)的抗高山反應(yīng)、抗衰老、抗疲勞等適應(yīng)原活性[4]。

內(nèi)生真菌，是生活于健康植物組織內(nèi)部，不引起植物明顯病原特征的微生物[5]。在長(zhǎng)期的共進(jìn)化過(guò)程中，內(nèi)生真菌與宿主共同應(yīng)對(duì)各種生物與非生物脅迫，形成了專一性很強(qiáng)的共生關(guān)系[5-6]。自1993年Stierle等[6]從紅豆杉內(nèi)生真菌Taxomyces andreanae中分離出紫杉醇以來(lái)，人們陸續(xù)從特定功能的藥用植物中分離出了類似功能的多種內(nèi)生真菌[7]。因此，從特定藥理功能植物中尋找特定活性的內(nèi)生真菌已成為尋找新天然產(chǎn)物的研究熱點(diǎn)[8]。

截至目前，大多數(shù)這樣的內(nèi)生真菌來(lái)自于溫帶或亞熱帶植物[9]，而對(duì)高山、海洋等特殊環(huán)境中的植物，尤其是具有特定功能的珍稀植物研究很少[10]。尤其是對(duì)于紅景天內(nèi)生真菌的研究，國(guó)內(nèi)外均無(wú)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)我國(guó)主要的紅景天品種——柴胡紅景天（Rhodiola bupleuroides）內(nèi)生真菌進(jìn)行了研究，獲得一株具有開發(fā)價(jià)值的抗氧化活性內(nèi)生真菌，在明確其分類地位的基礎(chǔ)上，評(píng)價(jià)其抗氧化活性，為這一資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

柴胡紅景天于2012年9月采集于西藏米拉山口（海拔5 700 m，東經(jīng)92 °22’50”，北緯29 °11’25”），由山西大學(xué)崔晉龍副教授鑒定為柴胡紅景天（R. bupleuroides）[11]。真菌Rb-R-1分離自柴胡紅景天的健康塊莖。以上材料與菌種均保藏于山西大學(xué)應(yīng)用化學(xué)研究所。

1.2儀器與設(shè)備

PTX200聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)Bio-Rad公司；BX53攝影生物顯微鏡 日本Olympus公司；HEI-VAP/LR20旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀德國(guó)Heidolph公司；CS/50CXII型高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司；UV2450型紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.3方法

1.3.1真菌Rb-R-1的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：將真菌Rb-R-1接種于察氏（Czapek’s，CZ）培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)7 d，觀察菌落形態(tài)特征；挑取菌絲，在顯微鏡下觀察菌絲、孢子、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等特征，鑒定真菌Rb-R-1的屬種。

分子鑒定：采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）法提取真菌R b-R-1的基因組D N A，用引物I T S 1（T C C G T A G G T G A A C C T G C G G）和I T S 4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）[12]對(duì)真菌rDNA-ITS進(jìn)行PCR擴(kuò)增，程序?yàn)?4℃3 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保藏。將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，將序列提交至GenBank（http∶//www.ncbi. nlm.nih.gov/），進(jìn)行BLAST比對(duì)，采用MEGA 4.0軟件進(jìn)行相似菌種的Neighbor-Joining（NJ）遺傳樹構(gòu)建，確定其遺傳關(guān)系，最終確定其屬種地位。

1.3.2內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物中總酚、總黃酮含量的測(cè)定

將純化好的內(nèi)生真菌Rb-R-1接種于裝有100 mL液體CZ培養(yǎng)基的三角瓶（250 mL）中，25℃、120 r/min培養(yǎng)10 d，4層紗布過(guò)濾。收集濾液，10 000 r/min離心10 min，取上清液，加入5倍體積的95%乙醇，去除沉淀。上清液于45℃、8×103Pa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，獲得發(fā)酵液濃縮物，稱質(zhì)量。加無(wú)菌去離子水定容為10 mg/mL的樣液，置于4℃條件下備用。

總酚含量的測(cè)定采用Fo lin-酚法[13]：配制0.05、0.10、0.15、0.25、0.50 mg/mL的沒食子酸對(duì)照品梯度溶液，分別移取1 mL于100 mL容量瓶中，加入60 mL水、5 mL Folin-酚試劑混勻；在0.5～8 min內(nèi)，加入15 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%Na2CO3溶液，搖勻，去離子水定容；20℃放置2 h，于765 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝1.396 96x-0.001 28（R2＝0.999 9）。

總黃酮含量的測(cè)定采用蘆丁法[14]：分別移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL蘆丁對(duì)照品溶液（0.20 mg/mL）至10 mL容量瓶中，分別加入5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min；再加入10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min；最后加入10%NaOH溶液4.0 mL，去離子水定容后搖勻；放置15 min，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝8.238 19x-0.009 5（R2＝0.999 3）。

以1 mL樣液分別代替沒食子酸和蘆丁，通過(guò)上述方法和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出真菌發(fā)酵液粗提物中的總酚、總黃酮含量。

1.3.3內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化能力測(cè)定

內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羥自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力，亞鐵離子（Fe2+）螯合能力測(cè)定及計(jì)算參照文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行；亞硝酸根離子（NO2-）清除能力測(cè)定及計(jì)算參照文獻(xiàn)[16]的方法進(jìn)行。

采用南京建成生物工程研究所研制的總抗氧化能力測(cè)定試劑盒對(duì)內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的總抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定。總抗氧化能力（U）定義為在37℃時(shí)，每分鐘每毫升待測(cè)液使反應(yīng)體系的光密度（OD520nm）值每增加0.01為一個(gè)總抗氧化能力單位。根據(jù)下式計(jì)算內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的總抗氧化能力。

式中：OD0為空白對(duì)照組的光密度；ODi為樣品組或陽(yáng)性對(duì)照組反應(yīng)體系的光密度；發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量＝待測(cè)液體積/mL×待測(cè)液質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

以上實(shí)驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)。O2-·清除能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)中以乙二胺四乙酸二鈉（ethylene diamine tetraacetic aciddisodium salt，EDTA-2Na）為陽(yáng)性對(duì)照，其余實(shí)驗(yàn)均以VC為陽(yáng)性對(duì)照。各抗氧化實(shí)驗(yàn)中內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化能力以IC50值表示，其值越小，表明發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化能力越強(qiáng)。

1.3.4內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.3.4.1單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以CZ培養(yǎng)基為菌種發(fā)酵的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以DPPH自由基清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別測(cè)定不同碳源、氮源、初始pH值、發(fā)酵溫度、裝液量、發(fā)酵時(shí)間對(duì)內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物DPPH自由基清除能力的影響。

分別選擇可溶性淀粉（C-A）、乳糖（C-B）、蔗糖（C-C）、葡萄糖（C-D）、麥芽糖（C-E）為內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵的碳源，添加量均為30 g/L；固定氮源為硝酸鈉、pH值為7.0、發(fā)酵溫度為30℃、裝液量為120 mL、發(fā)酵時(shí)間為8 d，測(cè)定發(fā)酵完成后產(chǎn)物的DPPH自由基清除率。

分別以酵母膏（N-A）、蛋白胨（N-B）、牛肉膏（N-C）、硝酸鈉（N-D）、氯化銨（N-E）為內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵的氮源，添加量均為3 g/L；固定碳源為乳糖、pH值為7.0、發(fā)酵溫度為30℃、裝液量為120 mL、發(fā)酵時(shí)間為8 d，測(cè)定發(fā)酵完成后產(chǎn)物的DPPH自由基清除率。

分別以5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0為內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵的初始pH值；固定碳源為乳糖、氮源為牛肉膏、發(fā)酵溫度為30℃、裝液量為120 mL、發(fā)酵時(shí)間為8 d，測(cè)定發(fā)酵完成后產(chǎn)物的DPPH自由基清除率。

分別以15、20、25、30、35、38℃為內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵的發(fā)酵溫度；固定碳源為乳糖、氮源為牛肉膏、pH值為7.0、裝液量為120 mL、發(fā)酵時(shí)間為8 d，測(cè)定發(fā)酵完成后產(chǎn)物的DPPH自由基清除率。

分別以30、60、90、120、150、180 mL為內(nèi)生真菌Rb-R-1在250 mL三角瓶中發(fā)酵的裝液量；固定碳源為乳糖、氮源為牛肉膏、pH值為7.0、發(fā)酵溫度為25℃、發(fā)酵時(shí)間為8 d，測(cè)定發(fā)酵完成后產(chǎn)物的DPPH自由基清除率。

分別以4、6、8、10、12、14 d為內(nèi)生真菌Rb-R-1的發(fā)酵時(shí)間，固定碳源為乳糖、氮源為牛肉膏、pH值為7.0、發(fā)酵溫度為25℃、裝液量為90 mL，測(cè)定發(fā)酵完成后產(chǎn)物的DPPH自由基清除率。

1.3.4.2正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以獲得最佳發(fā)酵條件。選取碳源量、氮源量、初始pH值、發(fā)酵溫度、裝液量5個(gè)因素，每個(gè)因素選取4個(gè)水平，利用DPS軟件設(shè)計(jì)L16（45）正交試驗(yàn)，確定最佳發(fā)酵條件。在正交試驗(yàn)獲得的最佳發(fā)酵條件下，進(jìn)一步確定最佳發(fā)酵時(shí)間（分別培養(yǎng)4、6、8、10、12 d）。同時(shí)測(cè)定優(yōu)化條件下發(fā)酵液中的總酚、總黃酮含量，以最終確定內(nèi)生真菌Rb-R-1的最佳發(fā)酵條件。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

抗氧化實(shí)驗(yàn)中內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化能力數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 17.0分析完成。數(shù)據(jù)的差異顯著性采用DPS數(shù)據(jù)處理軟件，通過(guò)最小顯著差異法（least-significant difference，LSD）進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1內(nèi)生真菌Rb-R-1鑒定結(jié)果

內(nèi)生真菌Rb-R-1的菌落為黃褐色，表面菌絲黃白色，短絨狀，背面深橘黃色；分生孢子無(wú)色，圓柱狀，連續(xù)產(chǎn)生；分生孢子梗直，細(xì)長(zhǎng)，無(wú)色，分支不規(guī)則。結(jié)合文獻(xiàn)[17]的報(bào)道，鑒定此菌為柱孢屬真菌（Cylindrocarponsp.），其菌落形態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)如圖1所示。對(duì)該菌進(jìn)行rDNA-ITS測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果提交至GenBank，獲得序列登錄號(hào)為KJ542260，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果表明，該菌與Neonectria ramulariae（GenBank登錄號(hào)KM249079）具有100%的同源性和99%的相似性；另外，將該菌與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中同源性高度相似的菌種進(jìn)行NJ遺傳樹的構(gòu)建，進(jìn)一步確定了其遺傳關(guān)系（圖2）；結(jié)合前人研究成果[18]，最終確定N. ramulariae為C. obtusiusculum的有性型。因此，鑒定內(nèi)生真菌Rb-R-1為N. ramulariae或C. obtusiusculum真菌。

圖1 內(nèi)生真菌Rb-R-1的菌落（A）及顯微（B）形態(tài)特征Fig.1 Colony (A) and morphological (B) characteristics of Rb-R-1

圖2 基于rDNA-ITS序列構(gòu)建的Rb-R-1與其相似序列菌株的NJ遺傳樹Fig.2 Neighbor-Joining tree of Rb-R-1 and its similar isolates based on their rDNA-ITS sequences

2.2內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性及總酚與總黃酮含量

通過(guò)6種抗氧化活性測(cè)定方法對(duì)內(nèi)生真菌Rb-R-1的抗氧化能力進(jìn)行了評(píng)價(jià)，由表1可知，內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量濃度與抗氧化能力成量-效關(guān)系。隨著發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量濃度的增大，其抗氧化能力逐漸增強(qiáng)，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，其DPPH自由基清除率、·OH清除率、O2-·清除率、NO2-清除率、Fe2+螯合率、總抗氧化能力均達(dá)到最大值，分別為62.65%、79.99%、51.44%、28.00%、85.80%和4.72 U/mL。從IC50值可以看出，與陽(yáng)性對(duì)照VC和EDTA-2Na相比，內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物的DPPH自由基、·OH、O2-·清除能力和Fe2+螯合能力較好。內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物中總酚和總黃酮的含量分別為18.12、22.48 mg/g；總抗氧化能力測(cè)定結(jié)果表明，在質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物和VC的總抗氧化能力分別為4.72 U/mL和28.78 U/mL。

表1 不同質(zhì)量濃度內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化能力Table1 Antioxidant activities of the fermentation supernatant of Rb-R-1 at different concentrations

2.3內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2.3.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，不同單因素培養(yǎng)條件下，內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力不同。

圖3 不同碳源對(duì)內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物DPPH自由基清除能力的影響Fig.3 Effects of different carbon sources on the DPPH radical scavenging-capacity of Rb-R-1 fermentation products

如圖3所示，不同碳源培養(yǎng)條件下，內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力表現(xiàn)為乳糖（43.21%）＞蔗糖（37.69%）＞葡萄糖（36.40%）＞麥芽糖（35.91%）＞可溶性淀粉（32.53%）。

圖4 不同氮源對(duì)內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物DPPH自由基清除能力的影響Fig.4 Effects of different nitrogen sources on the DPPH radical scavenging-capacity of Rb-R-1 fermentation products

如圖4所示，不同氮源培養(yǎng)條件下，內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力表現(xiàn)為牛肉膏（56.40%）＞蛋白胨（54.36%）＞酵母膏（48.70%）＞硝酸鈉（45.14%）＞氯化銨（43.28%）。

以乳糖和牛肉膏分別為碳源和氮源時(shí)，各單因素試驗(yàn)結(jié)果（圖5～8）表明，當(dāng)初始pH值為7.0、發(fā)酵溫度為25 ℃、裝液量為90 mL/250 mL、發(fā)酵時(shí)間為10 d時(shí)，內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物具有最高的DPPH自由基清除率，分別為64.65%、68.61%、70.08%和78.71%。

圖5 不同初始pH值對(duì)內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物DPPH自由基清除能力的影響Fig.5 Effects of different pH values on the DPPH radical scavengingcapacity of Rb-R-1 fermentation products

圖6 不同發(fā)酵溫度對(duì)內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物DPPH自由基清除能力的影響Fig.6 Effects of different fermentation temperatures on the DPPH radical scavenging-capacity of Rb-R-1 fermentation products

圖7 不同裝液量對(duì)內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物DPPH自由基清除能力的影響Fig.7 Effects of different medium volumes on the DPPH radical scavenging-capacity of Rb-R-1 fermentation products

圖8 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物DPPH自由基清除能力的影響Fig.8 Effects of different fermentation times on the DPPH radical scavenging-capacity of Rb-R-1 fermentation products

2.3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 內(nèi)生真菌Rb-R-1最佳發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Orthogonal array design with experimental results for optimal culture conditions of Rb-R-1

各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）。極差R值的大小表示該因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響的大小，如表2所示，各因素對(duì)內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物DPPH自由基清除能力影響大小為：氮源量＞發(fā)酵溫度＞碳源量＞裝液量＞初始pH值。k值為不同發(fā)酵條件下同一因素相同水平下的DPPH自由基清除率平均值。取k值最大時(shí)對(duì)應(yīng)的因素水平，即可得出最優(yōu)組合為A1B1C3D2E2，即最佳發(fā)酵條件為碳源量（乳糖）20 g/L、氮源量（牛肉膏）1 g/L、初始pH 7.0、發(fā)酵溫度25℃、裝液量90 mL/250 mL。

進(jìn)一步對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。因素A、B、C、D、E差異均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），表明這5個(gè)因素對(duì)內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物DPPH自由基清除能力的影響都較大。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table3 Analysis of variance of the experimental results of orthogonal array dessiiggnn

以上述最佳發(fā)酵條件為基礎(chǔ)，再次進(jìn)行最佳發(fā)酵時(shí)間測(cè)定的單因素試驗(yàn)，結(jié)果表明，培養(yǎng)10 d后，內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到最大，為93.12%，明顯高于正交試驗(yàn)優(yōu)化前的單因素試驗(yàn)結(jié)果。在上述最優(yōu)發(fā)酵條件下，內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物中的總酚、總黃酮含量分別為19.14 mg/g和28.25 mg/g，均高于優(yōu)化前的含量，表明正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果良好。

3 討 論

新叢赤殼屬（Neonectriasp.）真菌是叢赤殼科（Nectriaceae）的重要成員，物種較多。1999年，分類學(xué)家重新澄清了其屬的概念，認(rèn)為它們的無(wú)性型均屬于柱孢屬（Cylindrocarpon）[19-20]。該真菌地理范圍分布很廣，遍布亞洲、歐洲、北美洲[21]。同時(shí)，Zhao Peng等[21]采用DNA條形碼（ITS rDNA、β-tubulin、EF-1α和RPB2）對(duì)該屬真菌的分類地位和遺傳關(guān)系進(jìn)行了詳細(xì)總結(jié)。該真菌與宿主共生方式多樣，曾經(jīng)作為蟲生真菌[22]、云杉小蠹蟲伴生真菌[21]、內(nèi)生真菌[21,23]、植物病原菌[18]被廣泛分離和研究。而在本實(shí)驗(yàn)中，此真菌作為內(nèi)生真菌從柴胡紅景天中被分離出來(lái)，這為高山植物紅景天微生態(tài)群落的探討提供了依據(jù)。

該真菌作為植物內(nèi)生真菌或菌根真菌從多種植物中分離出來(lái)，表現(xiàn)出了多種多樣的生物活性，是尋找天然產(chǎn)物的良好真菌資源。日本學(xué)者Shiono等[23]從糙米中分離了內(nèi)生真菌N. ramulariae，經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生的兩種新堿Pyrrospirones A和B具有抑制急性早幼粒細(xì)胞白血病HL-60細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能；另一項(xiàng)研究表明，N. ramulariae具有產(chǎn)生可以降解聚氨酯等塑料物質(zhì)的酶的能力[24]。而在本實(shí)驗(yàn)中，N. ramulariae被從以強(qiáng)抗氧化能力著稱的柴胡紅景天中分離出來(lái)，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抗氧化能力，這顯示出內(nèi)生真菌與宿主在功能上的一致性，這為進(jìn)一步豐富該真菌的功能多樣性提供了證據(jù)，也為從柴胡紅景天內(nèi)生真菌中尋找新的天然抗氧化劑提供了可能。

[1] MA Chaoyang, TANG Jian, WANG Hongxin, et al. Simultaneous determination of six active compounds in Rhodiola L. by RP-LC[J]. Chromatographla, 2008, 67∶ 383-388.

[2] PANOSSIAN A, WIKMAN G, SARRIS J. Rosenroot (Rhodiola rosea)∶ traditional use, chemical composition, pharmacology and clinical ef?cacy[J]. Phytomedicine, 2010, 17∶ 481-493.

[3] YOUSEF G G, GRACE M H, CHENG D M, et al. Comparative phytochemical characterization of three Rhodiola species[J]. Phytochemistry, 2006, 27∶ 2380-2391.

[4] KUMAR R, TAYADE A, CHAURASIA O P, et al. Evaluation of antioxidant activities and total phenol and flavonoid content of the hydro-alcoholic extracts of Rhodiola sp.[J]. Pharmacognosy Journal, 2010, 2∶ 431-435.

[5] PETRINI O, SIEBER T N, TOTI L, et al. Ecology, metabolite production, and substrate utilization in endophytic fungi[J]. Natural Toxins, 1992, 1∶ 185-196.

[6] STIERLE A, STROBEL G, STIERLE D. Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae, an endophytic fungus of Pacific yew[J]. Science, 1993, 260∶ 214-216.

[7] RODRIGUEZ R J, HENSON J, VOLKENBURGH E V, et al. Stress tolerance in plants via habitat-adapted symbiosis[J]. The ISME Journal, 2008, 2∶ 404-416.

[8] STROBEL G, DAISY B, CASTILLO U, et al. Natural products from endophytic microorganisms[J]. Journal of Natural Products, 2004, 67∶257-268.

[9] RODRIGUEZ R J, WHITE J F, AMOLD A E, et al. Fungal endophytes∶ diversity and functional roles[J]. New Phytologist, 2009, 182∶ 314-330.

[10] YU N H, KIM J A, JEONG M H, et al. Diversity of endophytic fungi associated with bryophyte in the maritime Antarctic (King George Island)[J]. Polar Biology, 2014, 37(1)∶ 27-36.

[11] 中國(guó)科學(xué)院《中國(guó)植物志》編輯委員會(huì). 中國(guó)植物志[M]. 北京∶ 科學(xué)出版社, 1984∶ 197.

[12] CUI Jinlong, GUO Shunxing, DONG Hailing, et al. Endophytic fungi from dragon’s blood specimen∶ isolation, identification, phylogenetic diversity and bioactivity[J]. Phytotherapy Research, 2011, 25∶ 1189-1195.

[13] KABIR F, TOW W W, HAMAUZU Y, et al. Antioxidant and cytoprotective activities of extracts prepared from fruit and vegetable wastes and by-products[J]. Food Chemistry, 2015, 167∶ 358-362.

[14] KARIMI E, MEHRABANJOUBANI P, KESHAVARZIAN M, et al. Identification and quantification of phenolic and flavonoid components in straw and seed husk of some rice varieties (Oryza sativa L.) and their antioxidant properties[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2014, 94(11)∶ 2324-2330.

[15] GUO Tan, WEI Lei, HOU Chenglin, et al. Antioxidant activities of extract and fractions from Tuber indicum Cooke & Massee[J]. Food Chemisity, 2011, 127∶ 1643-1640.

[16] CHOI S Y, CHUNG M J, SEO W D, et al. Inhibitory effects of Orostachys japonicus extracts on the formation of N-nitrosodimethylamine[J]. Journal of Agricultural and Food Chemisity, 2006, 54∶ 6075-6078.

[17] BAMETT H L, HUNTER B B. 半知菌屬圖解[M]. 沈崇堯, 譯. 北京∶科學(xué)出版社, 1977∶ 204.

[18] HIROOKA Y, ICHIHARA Y, MASUYA H, et al. Seed rot, a new disease of beech tree caused by Neonectria ramulariae (anamorph∶Cylindrocarpon obtusiusculum)[J]. Journal of Phytopathology, 2012, 160∶ 504-506.

[19] ROSSMAN A Y, SAMUELS G J, ROGERSON C T, et al. Genera of Bionectriaceae, Hypocreaceae and Nectriaceae (Hypocreales, Ascomycetes)[J]. Studies in Mycology, 1999, 42∶ 1-248.

[20] BRAYFORD D, HONDA B M, MANTIRI F R, et al. Neonectria and Cylindrocarpon∶ the Nectria mammoidea group and species lacking microconidia[J]. Mycologia, 2004, 96∶ 572-597.

[21] ZHAO Peng, LUO Jing, ZHUANG Wenying, et al. DNA barcoding of the fungal genus Neonectria and the discovery of two new species[J]. Science China Life Sciences, 2011, 54∶ 664-774.

[22] 張永杰, 孫炳達(dá), 張姝, 等. 分離自冬蟲夏草可培養(yǎng)真菌的多樣性研究[J]. 菌物學(xué)報(bào), 2010, 29(4)∶ 518-527.

[23] SHIONO Y, SHIMANUKI K, HIRAMATSU F, et al. Pyrrospirones A and B, apoptosis inducers in HL-60 cells, from an endophytic fungus, Neonectria ramulariae Wollenw KS-246[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2008, 18(23)∶ 6050-6053.

[24] ARACELI L T, GERARDO G S, RAUL R H, et al. Microbial enzymes involved in polyurethane biodegradation∶ a review[J]. Journal of Polymers and the Environment, 2012, 20∶ 258-265.

An Endophytic Fungus with Antioxidant Activity from Rhodiola bupleuroides

CUI Jinlong1, GUO Tingting1,2, WANG Junhong1, WANG Mengliang1,*
(1. Institute of Applied Chemistry, Shanxi University, Taiyuan 030006, China; 2. Institute of Biotechnology, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

In this study, we reported for the first time an endophytic fungus, named Rb-R-1, with antioxidant activity isolated and identified fromRhodiola bupleuroides. The isolate Rb-R-1 was affiliated toNeonectria ramulariaebelonging to the order Hypocrealesin the phylumAscomacota. The fungus possessed high scavenging activities against 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH),·OH, O2-·and NO2-radicals and Fe2+chelating activity, with half maximal inhibitory concentration (IC50) of 8.86, 4.40, 9.65, 16.53 and 1.91 mg/mL, respectively. The contents of total phenolics and total flavonoids in the concentrated culture supernatant of Rb-R-1 were 18.12 and 22.48 mg/g, respectively. The optimal culture conditions that provided maximal DPPH radical scavenging rate (93.12%) were determined as lactose as the carbon source, beef extract as the nitrogen source, initial pH 7.0, 90 mL of the medium in a 250-mL flask and 25℃. In the meantime, the maximal contents of total phenolics and total flavonoids of 19.14 and 28.25 mg/g, respectively, were obtained under these culture conditions.

Rhodiola bupleuroides; endophytic fungi; antioxidant; fermentation condition optimization

Q939.5

1002-6630（2015）17-0022-06

10.7506/spkx1002-6630-201517005

2014-11-03

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31270383）；2012年度高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目（20121401120001）；山西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2014011029-1）

崔晉龍（1976—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)檎湎∷幱弥参锛八幱谜婢Y源開發(fā)。E-mail：cjl717@163.com

*通信作者：王夢(mèng)亮（1966—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樗幬镏虚g體合成及開發(fā)。E-mail：mlwang@sxu.edu.cn