劉春雷，孫立斌，李相昕，梁寶生，齊曉芬，任 悅，李 丹,，江連洲,*

（1.寧德師范學院生物系，福建 寧德 352100；2.東北農業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

大豆7S和11S蛋白二級結構與表面疏水性相關性的研究

劉春雷1，孫立斌2，李相昕2，梁寶生2，齊曉芬2，任 悅2，李 丹1,2，江連洲2,*

（1.寧德師范學院生物系，福建 寧德 352100；2.東北農業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

以6個具有代表性的大豆品種作為實驗材料提取7S和11S蛋白，并經Superdex 200凝膠柱層析進行純化，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳驗證其純度均在90%以上。采用傅里葉紅外光譜分析7S和11S蛋白的二級結構，采用ANS熒光探針法測定7S和11S蛋白的表面疏水性，利用相關性分析探討7S和11S蛋白表面疏水性與二級結構的構效關系。經分析得出：大豆蛋白的表面疏水性與α-螺旋含量成負相關；與β-折疊含量成負相關；與β-轉角含量成正相關，與無規(guī)卷曲含量成正相關。

7S和11S蛋白；二級結構；傅里葉紅外光譜；表面疏水性；相關性

蛋白質的表面疏水性影響蛋白質分子間的相互作用，相比于整體的疏水性，表面疏水性對蛋白質的功能具有更大的影響，是衡量蛋白質功能性質的關鍵指標之一[1]。大豆蛋白質的結構及性質隨大豆種類和產地的不同而有所不同[2-6]，且目前對大豆蛋白質構象的研究結論各有不同[7-10]?；谝陨鲜聦?，本研究選擇我國常用的、具有區(qū)域代表性的6個大豆品種做為實驗材料，研究大豆蛋白二級結構對表面疏水性的影響。以提取純化的7S和11S大豆蛋白組分為研究對象，其目的是為了最大限度地排除大豆蛋白7S和11S組分協(xié)同作用的影響。并且，在實驗中嚴格控制使不同品種的7S和11S蛋白制備條件完全一致，以消除實驗條件差異對大豆蛋白結構及性質的影響，準確分析不同品種大豆7S和11S蛋白的二級結構及表面疏水性，探討大豆7S和11S蛋白二級結構對表面疏水性的影響。最終明確大豆蛋白質二級結構與表面疏水性的構效關系，為今后開發(fā)大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）特定功能性產品而進行分子設計和重組提供重要的理論指導和技術支持。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

大豆：東農42東北農業(yè)大學大豆研究所；黑農46、合豐55黑龍江省農業(yè)科學院大豆所；冀豆12河北省農林科學院糧油作物研究所；皖豆28安徽省農業(yè)科學院作物研究所；福豆234福建省農業(yè)科學院作物研究所。大豆粉碎后過40目篩，用正己烷脫脂，得脫脂大豆粉。

1-苯胺基-8-萘磺酸（1-anilino-8-naphthalisene sulfonate acid，ANS） 美國Sigma公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2儀器與設備

AKTA Explorer蛋白質純化儀 美國GE公司；Mini-Protean 4電泳儀 美國Bio-Rad公司；Tanon凝膠成像系統(tǒng) 上海天能科技有限公司；F-4500熒光分光光度計日本Hitachi公司；MAGNA-IR560傅里葉變換紅外光譜系統(tǒng) 美國尼高力儀器公司。

1.3方法

1.3.1 7S和11S蛋白的制備

參照Nagano[11]、Liu Chun[12]、孫鵬[13]等方法稍加修改。

11S蛋白制備流程如下：脫脂豆粉→0.03 mol/L Tris-HCl緩沖液（料液比1∶15（m/V））、pH 8.5、45℃水浴中攪拌1 h→離心（4℃，9 600×g，30 min）→上清液→加固體至0.01 mol/L，調pH 6.4，4℃過夜→離心（4℃，6 500×g，20 min）→沉淀→溶于pH 7.6的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）（2.6 mmol/L KH2PO4、32.5 mmol/L K2HPO4、0.4 mol/L NaCl、10 mmol/Lβ-巰基乙醇，離子強度0.5，pH 7.6）→離心（4℃，9 600×g，30 min）→上清液→凝膠柱層析純化（Superdex 200凝膠柱，流速1 mL/min，洗脫液為pH 7.6的PBS）→收集液→透析→凍干→11S蛋白。

7S蛋白制備流程如下：4 ℃過夜冷沉離心上清液→調pH 4.8→離心（4 ℃，6 500×g，20 min）→沉淀→復溶于4 ℃、pH 8.5的0.03 mol/L Tris-HCl緩沖液→調pH 6.2→離心（4 ℃，9 600×g，30 min）→上清液→調pH 7.6→51%的飽和硫酸銨鹽析→離心（4 ℃，9 600×g，30 min）→上清液→100%的飽和硫酸銨鹽析→離心（4 ℃，6 500×g，20 min）→沉淀溶于pH 7.6的PBS→凝膠柱層析純化（條件同11S）→收集液→透析→凍干→7S蛋白。

1.3.2 7S和11S蛋白的純度鑒定

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）還原電泳方法測定7S和11S蛋白的純度。SDS-PAGE采用不連續(xù)垂直板狀凝膠電泳[14-15]。凝膠厚度1 mm，5%濃縮膠，12%分離膠。電泳凝膠分析采用Tanon凝膠成像系統(tǒng)軟件分析。

1.3.3表面疏水性的測定

采用ANS熒光探針法[16-17]。分別稱取0.25 g蛋白樣品溶于50 mL PBS（2.6 mmol/L KH2PO4、32.5 mmol/L K2HPO4，pH 7.6），室溫下攪拌1 h，20 ℃、10 000 r/min離心30 min，上清液用同一PBS依次稀釋（采用Lowry法測定蛋白質質量濃度在0.07～0.67 mg/mL之間）。分別取不同質量濃度的稀釋樣品4 mL，加入40μL濃度為8 mmol/L的ANS溶液（采用上述PBS配制），迅速混勻后靜置3 min，在390 nm的激發(fā)波長和470 nm的發(fā)射波長下測定熒光強度，狹縫5 nm，同時測定未加ANS的相應濃度的樣品溶液的熒光強度做空白。以蛋白質質量濃度為橫坐標，熒光強度為縱坐標作圖，曲線初始階段的斜率即為蛋白質分子的表面疏水性指數(shù)S0。

1.3.4傅里葉紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）分析

采用溴化鉀壓片法。室溫下以空氣為背景，測量波數(shù)范圍為4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)64次[18]。對譜圖酰胺Ⅰ帶（1 600～1 700 cm-1）進行基線校正、Savitsk-Go1ay函數(shù)平滑處理[19]，在二階導數(shù)譜基礎上采用Gauss分峰擬合[20]，多次擬合使殘差最小（r2≥0.999）。計算擬合圖譜中各子峰積分面積得到二級結構4種類型的相對百分含量。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

單項實驗重復3次，結果表示為采用IBM SPSS Statistics 19軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和相關性分析，如果方差分析差異性顯著（P＜0.05），則使用Duncan’s進行多重比較。采用Peakfit Version 4.12軟件進行圖譜分析處理，采用Origin 8.0軟件進行圖表制作。

2 結果與分析

2.1 7S和11S蛋白的純度鑒定

SDS-PAGE純度鑒定結果為：東農42-11S 95.05%，黑農46-11S 97.30%，合豐55-11S 99.07%，冀豆12-11S 95.97%，皖豆28-11S 96.08%，福豆234-11S 97.05%，東農42-7S 93.46%，黑農46-7S 93.74%，合豐55-7S 92.18%，冀豆12-7S 94.75%，皖豆28-7S 92.68%，福豆234-7S 93.53%?？梢姡?S和11S蛋白的純度均在90%以上，滿足實驗要求。

2.2 7S和11S蛋白的紅外光譜分析

不同品種7S和11S蛋白的FT-IR譜圖如圖1所示。6個大豆品種的7S和11S蛋白的紅外光譜相似，在酰胺Ⅰ帶有很強的吸收，說明樣品蛋白質含量非常高。

圖1 不同品種大豆7S蛋白（a）和11S蛋白（b）的FT-IR譜圖Fig.1 FT-IR spectra of 7S (a) and 11S (b) proteins derived from different soybean varieties

不同品種7S和11S蛋白的二級結構信息重疊在紅外光譜的酰胺Ⅰ帶里，本實驗利用波段縮小技術將FT-IR譜圖中的酰胺Ⅰ帶細分，得到α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)卷曲等二級結構的定性定量信息。蛋白質二級結構的定量方式有多種，采用分析結果較為準確的二階導數(shù)紅外去卷積光譜擬合[21]。對不同品種7S和11S蛋白的FT-IR分析依次進行基線校正、去卷積處理、二階導數(shù)擬合處理，經多次擬合確保擬合殘差最小。不同品種7S和11S蛋白的FT-IR酰胺Ⅰ帶去卷積二階導數(shù)擬合圖譜如圖2、3所示。

圖2 不同品種大豆7S蛋白的酰胺I帶擬合圖譜Fig.2 Second-derivative FT-IR spectra in the amide I region and Gaussian curve fitting for 7S proteins derived from different soybean varieties

圖3 不同品種大豆11S蛋白的酰胺I帶擬合圖譜Fig.3 Second-derivative FT-IR spectra in the amide I region and Gaussian curve fitting for 11S protein derived from different soybean varieties

擬合圖譜中各子峰與二級結構對應關系為：1 612 cm-1附近的吸收峰為蛋白質和多肽的側鏈吸收，1 623～1 632 cm-1為β-折疊結構；1 640～1 649 cm-1為無規(guī)卷曲結構；1 650～1 660 cm-1為α-螺旋結構；1 661～1 700 cm-1為β-轉角結構[22]。通過計算各子峰積分面積得到不同品種7S和11S蛋白的二級結構定量信息，即α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)卷曲的相對百分含量，見表1。

表1 不同品種大豆7S和11S蛋白的FT-IR酰胺I帶擬合結果Table1 Secondary structure contents of 7S and 11S protein from different soybean varieties based on second-derivative FT-IR spectrum in the amide I regionn

由表1可知，6個品種7S蛋白的二級結構以β-折疊含量最高，α-螺旋含量最少。6個品種7S蛋白的α-螺旋含量、β-折疊含量、β-轉角含量和無規(guī)卷曲含量均存在極顯著差異（P＜0.01）。東農42-7S的α-螺旋含量和β-折疊含量顯著高于其他5個品種，β-轉角含量和無規(guī)卷曲含量顯著低于其他5個品種。合豐55-7S的β-折疊含量顯著低于其他5個品種，β-轉角含量顯著高于其他5個品種。福豆234-7S的α-螺旋含量顯著低于其他5個品種，無規(guī)卷曲含量顯著高于其他5個品種。6個品種11S蛋白的二級結構以β-折疊含量最高，α-螺旋含量最少。6個品種11S蛋白的α-螺旋含量、β-折疊含量、β-轉角含量和無規(guī)卷曲含量均存在極顯著差異（P＜0.01）。東農42-11S的α-螺旋含量顯著低于其他5個品種，無規(guī)卷曲含量顯著高于其他5個品種。合豐55-11S的β-折疊含量顯著低于其他5個品種。福豆234-11S的α-螺旋含量和β-折疊含量顯著高于其他5個品種，無規(guī)卷曲含量顯著低于其他5個品種。

2.3 7S和11S蛋白的表面疏水性

圖4 不同品種大豆蛋白純品7S（a）和11S（b）的表面疏水性Fig.4 Surface hydrophobicity of 7S (a) and 11S (b) derived from different soybean varieties

本研究測定的是未經任何處理的大豆7S和11S蛋白的表面疏水性，并且實驗中嚴格控制使測定環(huán)境條件一致，排除環(huán)境因素及測定條件對表面疏水性的影響，以準確分析不同大豆品種的7S和11S蛋白的表面疏水性與其二級結構之間的構效關系。如圖4所示，6個品種7S蛋白的表面疏水性指數(shù)存在極顯著差異（P＜0.01），S0數(shù)值在707.14～868.54之間，從大到小依次為868.54（合豐55-7S）＞832.51（福豆234-7S）＞816.98（黑農46-7S）＞749.06（冀豆12-7S）＞729.02（皖豆28-7S）＞707.14（東農42-7S）。6個品種11S蛋白的表面疏水性指數(shù)存在極顯著差異（P＜0.01），S0數(shù)值在1 432.73～1 623.00之間，從大到小依次為1 623.00（東農42-11S）＞1 588.43（合豐55-11S）＞1 561.13（黑農46-11S）＞1 486.93（冀豆12-11S）＞1 463.93（皖豆28-11S）＞1 432.73（福豆234-11S）。

2.4 7S和11S蛋白二級結構與表面疏水性的關系

相關性分析表明，7S蛋白的表面疏水性與α-螺旋含量成顯著負相關，相關性系數(shù)為-0.890（P=0.018）；與β-折疊含量成顯著負相關，相關性系數(shù)為-0.852（P=0.031）；與β-轉角含量成顯著正相關，相關性系數(shù)為0.897（P=0.015）；與無規(guī)卷曲含量成顯著正相關，相關性系數(shù)為0.848（P=0.033）。11S蛋白的表面疏水性與α-螺旋含量成顯著負相關，相關性系數(shù)為-0.898（P=0.015）；與β-折疊含量成顯著負相關，相關性系數(shù)為-0.850（P=0.032）；與β-轉角含量成顯著正相關，相關性系數(shù)為0.873（P=0.023）；與無規(guī)卷曲含量成顯著正相關，相關性系數(shù)為0.892（P=0.017）。相關性分析結果說明大豆蛋白的表面疏水性隨著二級結構中α-螺旋含量和β-折疊含量的減少而增大，隨著β-轉角含量和無規(guī)卷曲含量的升高而增大。

3 結 論

綜上分析，大豆蛋白質的二級結構與表面疏水性相關性顯著：大豆蛋白質的表面疏水性與α-螺旋含量成顯著負相關（r=-0.890～-0.898），與β-折疊含量成顯著負相關（r=-0.850～-0.852），與β-轉角含量成顯著正相關（r=0.873～0.897），與無規(guī)卷曲含量成顯著正相關（r=0.848～0.892）。

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Correlation of Secondary Structures of 7S and 11S Soybean Proteins and Their Surface Hydrophobicity

LIU Chunlei1, SUN Libin2, LI Xiangxin2, LIANG Baosheng2, QI Xiaofen2, REN Yue2, LI Dan1,2, JIANG Lianzhou2,*
(1. Department of Biology, Ningde Normal University, Ningde 352100, China; 2. College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

7S and 11S proteins were extracted from six representative soybean varieties, and purified with Superdex 200 gel column chromatography to a purity more than 90%as determined by using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).The secondary structures of7S and 11S proteins were analyzed with Fourier transform infrared spectroscopy. The surface hydrophobicities of 7S and 11S proteins were determined with 1-anilinonaphthalene-8-sulfonic acid (ANS) fluorescence probe method. The structure-activity relationship was discussed with correlation analysis. It was concluded that the surface hydrophobicity of the soybean proteins was negatively related to alpha helix content and beta folding content but was positively correlated with beta angle content and random curl content.

7S and 11S protein; secondary structure; Fourier transform infrared spectroscopy; surface hydrophobicity; correlation

TS251.1

1002-6630（2015）17-0028-05

10.7506/spkx1002-6630-201517006

2015-02-09

國家自然科學基金面上項目（C200504）；福建省科學技術廳農業(yè)引導性（重點）項目（2013N0028）

劉春雷（1981—），男，講師，碩士，研究方向為農產品加工。E-mail：chunleiliu@163.com

*通信作者：江連洲（1960—），男，教授，博士，研究方向為糧食、油脂及植物蛋白工程。E-mail：jlzname@163.com